帕莫酸在制備BLyS拮抗劑的用圖
【專利摘要】本發明公開了帕莫酸在制備BLyS拮抗劑的用途。實驗表明：帕莫酸能夠抑制BLyS與TACI?Fc的結合。抑制作用與帕莫酸濃度的濃度呈正相關。并證明帕莫酸的抑制作用是特異和有效的。實驗表明：帕莫酸能夠抑制BLyS與BCMA?Fc的結合。抑制作用與帕莫酸濃度的濃度呈正相關。并證明帕莫酸的抑制作用是特異和有效的。
【專利說明】
帕莫酸在制備BLyS括抗劑的用途
技術領域
[0001]本發明屬于生物醫藥領域，涉及帕莫酸在制備BLyS拮抗劑的用途。
【背景技術】
[0002]B淋巴細胞刺激因子(B lymphocyte stimulator，BLyS)，又稱為B細胞激活因子(Bcell activating factor belonging to the TNF family，BAFF)，是TNF家方矣中的一員。由單核細胞和巨噬細胞持續合成、分泌。BLyS能夠結合B細胞表面的三種受體，B細胞成熟抗原(B cell mature antigen，BCMA)，跨膜激活物和CAML結合物(Transmembrane activatorand CAML-1nteractor，TACI)以及BAFF受體3(BR3)。受體結合BAFF后，減少成熟B細胞的凋亡。如果敲除BAFF，小鼠體內的成熟B細胞完全缺失。由于BLyS在B淋巴細胞活化、增殖中發揮重要作用，而B淋巴細胞產生的抗體所介導的體液免疫在眾多已發現的自身免疫性疾病當中處于中心地位。目前認為BLyS在體內的過量表達與某些自身免疫性疾病如系統性紅斑狼瘡(SLE)、類風濕性關節炎(RA)等病程的發生、發展密切相關^因此，以阻斷BLyS生物學功能為策略，探討BLyS抑制拮抗劑治療系統性紅斑狼瘡和類風濕性關節炎等自身免疫性疾病和B細胞腫瘤疾病的研究正在國外如火如荼的進行中。目前，針對BLyS的抑制劑的研究主要集中在研制具有中和BLyS作用的BLyS誘懼受體(decoy receptor)、抗BLyS抗體和措抗肽[1-3]。2011年3月美國FDA批準由人類基因科學公司(Human Genome Sciences)和葛蘭士-史克(GlaxoSmithKline)公司聯合研發的抗BLyS抗體BENLYSTA(Belimumab)治療系統性紅斑狼瘡。這是50年來，FDA首次批準治療該類疾病的藥物。但是蛋白抑制劑作為治療藥物具有一定的局限性，例如來源較少和分離純化難度大以及藥物穩定性較差，另外還存在口服的生物利用度較低，主要是因為體內各種酶對多肽類藥物的降解性高，從而會導致這一類藥物的作用半衰期大大縮短。因此，開發小分子化合物作為BLyS抑制劑的研究具有重要的現實意義。
[0003]目前，尚未有帕莫酸在制備BLyS拮抗劑的用途的報道。
[0004]1.Jian Sun*(孫劍)，Zhou Lin ,Jiannan Feng,Yan Li ,Beifen Shen.(2008)BAFF — targeting therapy , a promising strategy for treating auto immunediseases.Eur J Pharmacol 597:1-5.
[0005]2.Yacong Zhao ,Xiafei Hao，Jiannan Feng ,Beif en ShenjJing Wei*(魏靜)，Jian Sun5K孫劍)(2015)，The comparison of BLyS-binding peptides from phagedisplay library andcomputer—aided design on BLyS-TACI interact1n.1ntImmunopharmacoI，24:219-223.
[0006]3.Xiafei Hao,Yanfeng Zhu,Chang Zheng,Xuegang FujJiannan FengjBeifenShenjJing Wei*(魏靜)，Jian Sun^(#^lJ).A comparison of b1logical activity of Blymphocyte stimulator(BLyS)antagonist peptibodies and the elucidat1n ofpossible BLyS binding sites.Protein&Peptide Letters，2016，23，17-23
[0007]4.Xuegang FujLiyan Xuan,Yuzhe WangjJing Wei*(魏靜)，Jian Sun*(孫劍).Molecular mechanism of the affinity interact1ns between BAFF and itspeptides by molecular simulat1ns.Protein&Peptide Letters,2015,22,992-999.

【發明內容】

[0008]本發明的目的是克服現有技術的不足，提供帕莫酸在制備BLyS拮抗劑藥物的用途。
[0009]本發明的技術方案概述如下:
[0010]帕莫酸在制備BLyS拮抗劑的用途。
[0011]本發明的優點:
[0012]1.對于BLyS結合TACI具有顯著抑制作用
[0013]競爭ELISA實驗結果表明:帕莫酸濃度在lmg/mL時能夠抑制2.71 ± 2.51 %BLyS與TAC1-Fe的結合;在3mg/mL時能夠抑制12.36 ± 6.38 % BLy S與TAC1-Fe的結合;在5mg/mL時能夠抑制79.68±2.68%BLyS與TAC1-Fc的結合。抑制作用與帕莫酸濃度的濃度呈正相關。
[0014]非結合BAFF的小分子化合物(苯甲酸)，即陰性對照，對BLyS與TACI的相互作用沒有明顯抑制作用、且沒有劑量依賴關系。證明帕莫酸的抑制作用是特異和有效的。
[0015]2.對于BLyS結合BCMA具有顯著抑制作用
[0016]競爭ELISA實驗結果表明:帕莫酸濃度在lmg/mL時能夠抑制5.59±2.01%BLyS與BCMA-Fc的結合;在3mg/mL時能夠抑制8.91 ± 4.36 %BLyS與BCMA-Fc的結合；在5mg/mL時能夠抑制83.72±0.89%BLyS與BCMA-Fc的結合。抑制作用與帕莫酸濃度的濃度呈正相關。
[0017]陰性對照化合物苯甲酸對BLyS與BCMA的相互作用沒有明顯抑制作用、且沒有劑量依賴關系。證明帕莫酸的抑制作用是特異和有效的。
【附圖說明】
[0018]圖1為BLyS結合受體的關鍵殘基，其中+表不關鍵殘基。
[0019]圖2為BLyS結合口袋的分子表面和關鍵殘基，Dl表示保守性結合區域，D2表示特異性結合區域。
[0020]圖3為虛擬篩選流程圖。
[0021]圖4為帕莫酸結構式。
[0022]圖5為帕莫酸與BLyS的相互作用的模式。
[0023]圖6為帕莫酸抑制TACI對BLyS的結合作用。#代表p〈0.01。
[0024]圖7為帕莫酸抑對BLyS的結合作用。林代表p〈0.01。
【具體實施方式】
[0025]下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。眾多研究已經詳細闡述BLyS與受體相互作用的可能模式及關鍵氨基酸。我們在前期工作中通過分子動力學模擬，基于BLyS和其受體BCMA的晶體結構，通過計算機模擬BLyS與其三個天然受體的相互作用模式，探究其參與保守性結合作用和親和力選擇性的關鍵殘基。在此基礎上，利用“鎖鑰原理”，針對關鍵結合區域進行商業化化學小分子數據庫進行分子虛擬篩選，預測得到一系列具有潛在抑制作用的小分子化合物，獲得其實體并進行體外活性測定發現，二元酸類化合物帕莫酸具有一定的抑制BLyS結合TACI和BCMA的作用。為開發有臨床應用前景的新藥先導藥物奠定了實驗研究基礎。
[0026]下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。本發明的實施例是為了使本領域的技術人員能夠實施，但并不對本發明作任何限制。其中的常用試劑的公開了是為了使本領域的技術人員更好的實施本發明，但并不對本發明作任何限制。
[0027]BLyS蛋白:孫劍，黎燕，馮建男，孫瑛勛，胡美茹，沈倍奮，.人可溶性B淋巴細胞刺激因子基因的克隆及在大腸桿菌中的表達[J].細胞與分子免疫學雜志，2006，(2)SEQ IDN0.8所示ο
[0028]TAC1-Fc蛋白:冀麗軍，白烏仁圖雅，柴琳，孫劍，.TAC1-Fc融合蛋白的基因構建、原核表達及生物活性鑒定[J].生物技術，2013，(3).SEQ ID N0.9所示
[0029]BCMA-Fc蛋白:孫劍，馮建男，林周，黎燕，沈倍奮.計算機輔助設計可溶性BLyS受體，eBCMA-Fc融合蛋白及其在大腸桿菌中的表達.中國生物化學與分子生物學報，2008，24
(2)SEQ ID N0.9所示。
[0030]Fe蛋白:吳真.BCMA-Fc作為潛在藥物的研究[D].天津大學，2012SEQ ID N0.10所不O
[0031 ]包被液:稱量出33.6g碳酸氫鈉和63.6g無水碳酸鈉，將其放入燒杯中，向內加入600ml蒸餾水，攪拌至溶質全部溶解，再加入蒸餾水中定容到1L。將其放在4°C下保存。
[0032]I3BST的配制:取250μ1吐溫-20加入500ml的I XI3BS中，混合均勻至完全融合。在室溫下保存。
[0033]5%脫脂奶粉的配制:稱取脫脂奶粉lg，攪拌下溶解于1ml 0.0lM PBS中，加PBS定容至20ml，于4 °C保存
[0034]TMB顯色液:取4.95ml底物緩沖液，0.05ml I%TMB儲液，臨用前加入5μ1 30%過氧化氫。
[0035]1%ΤΜΒ儲液:稱取Ig TMB，攪拌下充分溶解于80ml DMSO中，加DMSO定容至10ml，
保存于4°C。
[0036]底物緩沖液(pH 5.0):取24.3ml 0.1M檸檬酸，25.7ml 0.2M磷酸氫二鈉，加入約40ml水，調pH至5.0，再加水定容至10ml，保存于室溫。TMB工作液(現配現用)。
[0037]實施例1:用計算機模擬篩選技術，篩選出BLyS相關小分子化合物。
[0038]蛋白結構信息獲取:從Protein Date Bank蛋白質數據庫(//www.rcsb.0rg/pdb)中下載BLyS蛋白結構(PDB ID: 1QD和1QE)。采用分子動力學等計算方法，從分子水平上探究BLyS與其天然受體(BCMA，TACI，BR3)的相互作用機制。根據每個氨基酸殘基對結合能貢獻大小，確定其關鍵殘基。圖1和圖2分別顯示了 BLyS靶點天然受體的關鍵作用殘基，以及BLyS靶點的結合口袋和關鍵殘基的相關信息。
[0039]小分子數據庫的獲得:小分子數據庫含有近萬個結構不同的化合物，其主要來源于兩個途徑:天然產物數據庫或商用小分子數據庫中的小分子，課題組合成得到的系列化合物。商用小分子數據庫主要指百靈威(J&K)、阿法埃莎(Alfa-Aesar)、西格瑪奧德里奇(Sigma-Aldrich)三家試劑公司網站得到。對三維小分子結構進行加氫、加電荷處理后，將文件保存成Pdbqt文件格式，進行進一步的分子對接研究。
[0040]虛擬篩選:借助AutoDock 4.2軟件，將數據庫中所有小分子與BLyS活性中心區域進行篩選對接計算。分子對接過程中，將三維小分子結構數據逐一放在BLyS的活性位點處，通過不斷優化小分子模型的位置、構象、分子內部可旋轉鍵的二面角，尋找化合物與BLyS作用的最佳構象，并預測其結合模式。分析對接結果，根據給出的小分子預測結合分值，考察化合物與BLyS結合中心的匹配度，以及與關鍵氨基酸相互關系情況，篩選出潛在具有BLyS親和力的小分子候選化合物。分值越大，代表化合物與BLyS的親和力越高，即化合物可能有較好的親和力。選擇綜合評價最佳的化合物，獲得化合物實體，并進行ELISA實驗。圖3中描述了虛擬篩選的流程圖。
[0041 ]實施例2:計算機分析小分子措抗劑和BLyS結合模式。
[0042]利用計算機分子對接方法，結合Chimera軟件探討了帕莫酸(結構式參見圖4)與BLyS分子機制研究，分析其與BLyS相互識別的關鍵氨基酸殘基以及關鍵相互作用(圖5)。發現帕莫酸的一個苯環插入到BLyS的保守性疏水口袋，與Hi s69，Leu70和Il e92形成疏水相互作用，并與Argl24和Arg90殘基側鏈形成π-cat1n作用，共同加強帕莫酸與BLyS的結合作用;兩個羧基與BLyS的關鍵殘基Argl24和Arg90形成穩定的鹽橋作用；另外一個芐位的羰基與Argl 24形成氫鍵相互作用。
[0043]實施例3:競爭ELISA分析化合物對于BLyS結合TACI/BCMA蛋白的抑制作用。
[0044]如果化合物帕莫酸可以與TACI/BCMA競爭結合BLyS活性口袋，則加入的化合物帕莫酸會抑制BLyS結合TACI/BCMA;相反，如果化合物不結合BLyS，也就不存在與TACI/BCMA競爭。則加入化合物帕莫酸對BLyS結合TACI/BCMA沒有影響。因此，通過競爭抑制ELISA實驗，來測試小分子帕莫酸阻斷BLyS與受體TACI和BCMA結合的作用。
[0045]首先，按常規ELISA方法做BLyS與TAC1-Fc/BCMA-Fc結合的ELISA。確定競爭抑制ELISA實驗中使用TAC1-Fc/BCMA-Fc的濃度。最終確定濃度是10yg/mL。競爭抑制ELISA的具體操作步驟如下:
[0046]a)包被:20g/mL的BLyS與包被液按1:1稀釋，制備10yg/mL的BLyS液。將稀釋的BLyS液按50微升/孔包被96孔板。4 0C過夜。
[0047]b)洗板后，用5%的脫脂奶粉室溫封閉2小時。
[0048]c)洗板，再將I Og/mL的TAC1-Fc或BCMA-Fc與不同體積的帕莫酸水溶液混合，制備小分子化合物帕莫酸終濃度梯度為O、1、3和5mg/mL的混合溶液，每孔加入50微升。37°C，溫育I小時。未加小分子溶液的混合溶液作為空白對照組。苯甲酸為陰性對照化合物。
[0049]d)洗板，加入HRP標記羊抗人2抗(按說明書稀釋)。
[0050]e)洗板后加入TMB顯色劑顯色。
[0051 ] f)終止反應，測450納米的OD值。化合物競爭BLyS與TAC1-Fc/BCMS-Fc的相互作用的抑制效果用下述公式計算:抑制率％ = [(空白對照組0D450-實驗組0D450)/空白對照組0D450]*100%。(抑制率見圖6和圖7)。
【主權項】
1.帕莫酸在制備BLyS拮抗劑的用途。
【文檔編號】A61P37/02GK106074476SQ201610411081
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月8日 公開號201610411081.3, CN 106074476 A, CN 106074476A, CN 201610411081, CN-A-106074476, CN106074476 A, CN106074476A, CN201610411081, CN201610411081.3
【發明人】孫劍, 魏靜, 傅學鋼, 郝霞飛
【申請人】天津大學