特異性拮抗c?Rel的siRNA在治療MS中的應用
【專利摘要】本發明提供特異性拮抗c?Rel的siRNA在治療MS中的應用，其是指針對c?Rel的拮抗劑在制備用于預防和/或治療由炎癥引起的疾病的藥物中的應用。本發明還提供拮抗c?Rel的siRNA以及相應的藥物組合物，該siRNA具有如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的序列。本發明所述組合物包含有效劑量的所述siRNA，以及藥學上可接受的載體。本發明所述siRNA可特異性拮抗c?Rel，從而減少c?Rel的表達，顯著減少炎癥細胞，使得本發明所述siRNA可預防和/或治療由炎癥引起的疾病，特別是包括多發性硬化癥在內的自身免疫性疾病。
【專利說明】
特異性拮抗c-Re I的s i RNA在治療MS中的應用
技術領域
[0001 ]本發明涉及特異性拮抗C-Re 1的s iRNA在治療MS (多發性硬化癥）中的應用。
【背景技術】
[0002] 由炎癥引發的疾病廣泛存在，例如多發性硬化疾病（簡稱MS)，其在世界范圍內患 病率為每10萬人中有30到80名患者，最高地區甚至高達每10萬人中200名患者。世界一共有 大約250萬患者，其中美國有大約40萬的患者。近年來國內多發性硬化癥患者顯著增多，保 守估計至少有2萬名患者。即便接受治療，也會經歷一個慢性的反復的病程，有可能導致殘 疾、甚至有些病患因心情低落而自殺隕命。因此，這類疾病又被稱為"不死的癌癥"，是公眾 因病致貧、因病返貧的重要原因，不僅給患者帶來了沉重的經濟負擔，同時也會對經濟發展 造成嚴重負擔。
[0003] 理想的抗炎藥物應至少滿足兩個基本條件：（1)可提供最強大的消除炎癥的效果； (2)沒有或很少的副作用，例如有害或不受歡迎的不良反應等。目前還沒有能治愈多發性硬 化癥的藥物，只有6種注射型的改變病情的藥被美國藥監局批準治療多發性硬化癥。這些藥 包括醋酸格拉替雷（glatiramer acetate(GA)((?〇paxonc.1f))，米托蒽醌（mitoxantrone (ΜIT 0) (Novantrone?).)，那他珠單抗（natalizumab (Tysabri?))和三種干擾（IFN) β 1 ( :Avon_ex?，、Rebif?^PBe；tasero_n?)。作為一線用藥的干擾素和GA僅能改善癥狀；由于毒性的 考量，米托蒽醌(mitoxantrone)和那他珠單抗注射液(natalizumab)僅能選擇性用于經常 復發和積累性殘疾的病人。這些藥物只能幫助降低復發的頻率和損傷的程度，病人的病情 還會逐漸的復發和加重。由于用于治療多發性硬化癥藥物廣泛的副作用，它們的臨床應用 價值受到限制，例如糖皮質激素只能在短時間內控制病人的急性炎癥反應。有效的減少藥 物副作用的方法是只針對引起疾病的分子靶標開發相應的藥物。
[0004] 核轉錄因子Rel/NF-κΒ家族代表了一種有效的治療炎癥性疾病的靶標。因為Rel/ NF-kB家族因子直接控制很多炎癥基因的表達，而這些炎癥因子在由炎癥引起的疾病(如自 身免疫疾病）的發病中起到很重要的作用。因此如果能夠阻止Rel/NF-κΒ家族因子的表達將 會有效的控制炎癥反應。目前上市的蛋白酶體抑制劑(如美國FDA批準的PS-341)對Rel/NF-κΒ有抑制作用。另外，目前應用臨床較多的糖皮質激素，也是因為可以抑制Rel/NF-κΒ家族 的表達而有效地控制炎癥反應。但是因為這些藥物不僅抑制Rel/NF-κΒ家族因子，并且作用 于其他很多不相關的分子，特異性差，因此這些藥的共同缺點是副作用大，只能短期使用， 控制急性由炎癥引起的疾病，例如過敏癥狀等。于此同時，沒有一種藥能有效的治療原發-進展型和繼發-進展型的多發性硬化癥。因此仍然需要開發出有效治療由炎癥引起的疾病， 特別是多發性硬化癥的藥物，盡可能地減少藥物的副作用，保障用藥的安全性。

【發明內容】

[0005] 本發明的主要目的在于尋找預防和/或治療由炎癥引起的疾病的藥物的新的靶 點，并以其為靶標，開發出特異性針對該靶點的藥物，以期望能有效預防和/或治療由炎癥 引起的疾病，特別是多發性硬化癥，降低毒副作用，保障用藥的安全。
[0006] 鑒于c-Rel在炎癥反應中的重要作用以及由炎癥引起的疾病(如自身免疫性多發 性硬化癥)的病理過程，本發明僅以NF-κΒ家族成員c-Re 1為靶點，通過抑制
[0007] c-Rel/IL-23/IL-17A炎癥軸來治療由炎癥引起的疾病，特別是包括多發性硬化癥 等的自身免疫性疾病。因而，本發明提供針對c-Rel的拮抗劑在制備用于預防和/或治療由 炎癥引起的疾病的藥物中的應用。本發明所述由炎癥引起的疾病包括自身免疫性疾病或移 植排斥反應，特別地，所述自身免疫性疾病為多發性硬化癥(簡稱MS，腦脊髓炎）。
[0008] 在本發明的一【具體實施方式】中，發明人在研究中發現，利用特異性拮抗c-Rel的 siRNA能夠降低c-Rel的表達，從而使得小鼠腦和脊髓內浸潤的炎性細胞明顯減少。因而，在 本發明前述應用的一【具體實施方式】中，所述針對c-Rel的拮抗劑為降低c-Rel的表達水平的 試劑，優選地，所述試劑為siRNA。更優選地，所述siRNA包含經修飾或未經修飾的如SEQ ID N0:1、SEQIDN0:2所示的序列，該修飾是指SEQIDN0:1或SEQIDN0 :2中帶U或C堿基的核 苷的2'位羥基各自獨立地被甲氧基取代，優選SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2中帶U或C堿基的 核苷中的2 '位羥基均被甲氧基取代。
[0009] 本發明SEQ ID N0:1、SEQ IDN0:2序列如下所示：
[0010] SEQ ID N0:1:CAACCGGACAUACCCGUCU。
[0011] SEQIDN0:2:AGACGGGUAUGUCCG⑶UG(SEQIDN0:1的反義序列）。
[0012] 作為本發明的一【具體實施方式】，前述siRNA序列為經修飾或未經修飾的如SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4所示的序列；該修飾是指SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4中帶U或C堿基的核 苷中的2'位羥基各自獨立地被甲氧基取代，優選SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中帶U或C堿基 的核苷中的2 '位羥基均被甲氧基取代。
[0013] 本發明SEQ ID N0:3、SEQ IDN0:4序列如下所示：
[0014] SEQ ID N0:3:CAACCGGACAUACCCGUCUTT。
[0015] SEQ ID N0:4:AGACGGGUAUGUCCG⑶UGTT(SEQ ID N0:3的反義序列）。
[0016] 本發明對SEQ ID NO: 1~4所示的序列進行修飾的目的在于增強其穩定性。另一方 面，本發明還提供一種拮抗c-Rel的siRNA，該siRNA包含經修飾或未經修飾的如SEQ ID N0: 1、SEQ ID NO: 2所示的序列，該修飾是指SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2中帶U或C堿基的核苷 的2'位羥基各自獨立地被甲氧基取代，優選SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2中帶U或C堿基的核 苷中的2 '位羥基均被甲氧基取代。
[0017] 作為本發明的一【具體實施方式】，前述siRNA序列為經修飾或未經修飾的如SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4所示的序列；該修飾是指SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4中帶U或C堿基的核 苷中的2'位羥基各自獨立地被甲氧基取代，優選SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中帶U或C堿基 的核苷中的2 '位羥基均被甲氧基取代。
[0018] 本發明所述s iRNA可按本領域常規的技術制備得到。
[0019] 由于本發明所述siRNA僅以c-Rel為靶點，能夠詰抗c-Rel的表達，從而具有以下明 顯優點：（a)與其他靶向于整個NF-kB家族相比的藥物相比，本發明所述siRNA僅以c-Re 1為 靶點，特異性好，使得副作用小；（b)通過本發明所述siRNA靶向c-Rel，能抑制下游一系列炎 性因子的表達，如11^-6、幾1-0、1?^丫、幾-12、幾-23、11^17等，因而，與僅以了陬-€[、幾-12、 IL-23、IL-17A等單一炎性因子為靶點的抗體或其他藥物相比，本發明所述siDNA能更有力 切斷例如先天性免疫與適應性免疫間的惡性炎癥等的回路，作用效果強；（C)現有技術表明 c-Rel敲除小鼠發育正常，并能抵抗自身免疫病的發生，因此，本發明以c-Rel為靶點的所述 siRNA安全性高；（d)由于c-Rel廣泛表達于活化的淋巴細胞和單核細胞，因而本發明所述以 c-Rel為靶點的siRNA可成為廣譜抗炎藥，能應用于預防和/或治療多種由炎癥引發的疾病， 例如自身免疫性疾病、移植排斥反應，特別地，所述自身免疫性疾病為多發性硬化癥。因此， 本發明以c-Rel為靶點的siRNA能安全、有效地用于預防和/或治療由炎癥引發的疾病，特別 是多發性硬化癥等自身免疫性疾病。
[0020] 另一方面，本發明提供一種拮抗C-Rel的藥物組合物，所述組合物包含有效劑量的 本發明所述siRNA，以及藥學上可接受的載體;優選地，所述藥物組合物為包含有效劑量的 所述siRNA的納米膠束。通過將本發明所述siRNA制備成納米膠束，可提高siRNA的轉染率， 避免或減少其在生物體內被酶降低，延長其半衰期。
[0021] 在本發明的一【具體實施方式】中，所述納米膠束的載體為PEG-PLL-PLLeu三嵌段共 聚物。本發明所述PEG-PLL-PLLeu三嵌段共聚物為現有三嵌段共聚物（J. Deng，N. Gao， Y.ffang,H.Yi,S.Fang,Y.Ma,et al.,Self-assembled cationic micelles based on PEG-PLL-PLLeu hybrid polypeptides as highly effective gene vectors , Biomacromoleculesl3(2012)3795-3804.)，其制備過程亦可參照該文獻。優選地，所述PEG-PLL-PLLeu三嵌段共聚物中PEG、PLL及PLLeu的摩爾比例為1:15~30:20~40;例如1:15: 20、 1:30:40、1:20:30、1:30:20或 1:20:20。
[0022] 優選地，所述三嵌段共聚物與所述siRNA的質量比為85~115:6~10。例如100yg的 PEG、PLL及PLLeu摩爾比為1:15: 20的前述三嵌段共聚物與8yg的所述siRNA進行混合，即可 得到所述藥物組合物。采用所述PEG-PLL-PLLeu三嵌段共聚物膠束來攜載本發明所述 siRNA，可將其轉運至細胞質中。本發明所采用的這種三嵌段共聚物膠束生物可降解、轉染 效率高，最重要的是，這種PEG-PLL-PLLeu三嵌段共聚物膠束主要富集于脾臟中并被其中樹 突狀細胞攝取。
[0023]再一方面，本發明提供所述的拮抗c-Rel的siRNA或所述的藥物組合物在制備預防 和/或治療由炎癥引起的疾病的藥物中的應用。優選地，所述由炎癥引起的疾病包括自身免 疫性疾病或移植排斥反應。特別地，所述自身免疫性疾病為多發性硬化癥。
[0024]綜合而言，本發明開發了特異性拮抗c-Rel的siRNA，該siRNA可減少c-Rel的表達， 顯著減少炎癥細胞，使得本發明所述siRNA可預防和/或治療由炎癥引起的疾病，特別是包 括多發性硬化癥在內的自身免疫性疾病。
【附圖說明】
[0025]圖1實施例1為納米粒子攜帶s iRNA的體內攝取情況。
[0026] 圖2實施例1siRNA的敲低效果驗證實驗結果。
[0027] 圖3實施例1細胞質和細胞核裂解液分離檢測c-Rel的表達實驗結果圖。
[0028] 圖4實施例2腦(上行)和脊髓(下行)切片H&E染色圖。
【具體實施方式】
[0029] 為了對本發明的技術特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，現結合具體實施 例及附圖對本發明的技術方案進行以下詳細說明，應理解這些實例僅用于說明本發明而不 用于限制本發明的范圍。實施例中，各原始試劑材料均可商購獲得，未注明具體條件的實驗 方法為所屬領域熟知的常規方法和常規條件，或按照儀器制造商所建議的條件。
[0030] 以下實施例中所采用的納米粒子的載體均為PEG-PLL-PLLeu三嵌段共聚物，該共 聚物中PEG、PLL及PLLeu的摩爾比例為1:15:20。按現有技術制備得到（1.〇6叫，16 &〇， Y.Wang,H.Yi,S.Fang,Y.Ma,et al.,Self-assembled cationic micelles based on PEG-PLL-PLLeu hybrid polypeptides as highly effective gene vectors , Biomacromoleculesl3(2012)3795-3804.)〇
[0031] 實施例1體外驗證實驗
[0032] 本實施例首先合成cy5標記的c-Rel特異的雙鏈siRNA(包含正義鏈SEQIDN0:3及 反義鏈SEQ ID N0:4，cy5標記在正義鏈5'端），該標記的序列如下所示：
[0033] cy5-CAACCGGACAUACC(XUCUTT(cy5-SEQ ID N0:3);
[0034] AGACGGGUAUGUCCGGUUGTT(SEQ ID NO:4)；
[0035] 將5μ1濃度為20μΜ的如上所得cy5標記的c-Rel特異的雙鏈siRNA與濃度為lyg/μL 的20μ1納米粒子(簡稱NPs)混合，室溫靜置20分鐘，制備得到納米粒子攜帶siRNA(納米粒子 +siRNA)。向6孔板中接種5X10 5/孔個RAW264.7細胞，12小時后中分成四組，一組為未處理 組，另外三組分別加入單獨納米粒子、單獨siRNA(前述cy5標記的c-Rel特異的雙鏈siRNA) 和納米粒子攜帶siRNA，體外攝取24小時后利用C6流式細胞儀檢測攝取效率。本實施例結果 如圖1中所示，從圖1中可以看出納米粒子攜帶的cy5-s iRNA能夠較好的被細胞攝取。
[0036]以5 X105/孔的密度將Raw264.7細胞種于6孔板中，12小時后將細胞分為三組，一 組不做處理，另外兩組分別加入制備好的納米粒子+陰性對照siRNA(記為納米粒子+NC，該 陰性對照siRNA是上海吉瑪公司提供的通用陰性對照），納米粒子+c-Rel siRNA(記為納米 粒子+si RNA，該siRNA的正義鏈的序列為CAACCGGACAUACCC GUCUTT，反義鏈的序列為 AGACGGGUAUGUCCG⑶UGTT，且該正義鏈及反義鏈中的所有帶U或C堿基的核苷中的2 '位羥基 被甲氧基取代，該siRNA由上海吉瑪基因公司按常規方法合成），48小時后通過Western Blot檢測c-Rel siRNA的敲低效果，其中微管蛋白作為內參蛋白定量樣品上樣品量。
[0037] Western Blot具體實驗步驟如下所述：
[0038] a.收集蛋白樣品；用RIPA裂解液裂解貼壁細胞，然后4°C，13，000g離心15min.取上 清液作為樣品。
[0039] b.電泳：制備電泳凝膠，進行SDS-PAGE。
[0040] c.轉膜：電泳結束后將膠條割至合適大小，用轉膜緩沖液平衡，5min X 3次。（轉膜 條件:300mA恒流;0 · 22um孔徑PVDF膜，轉膜時間75min。
[0041 ] 封閉:將膜完全浸沒封閉液中室溫輕搖60min。）
[0042] d.一抗孵育（c-Rel購自santa cruz)，核纖維蛋白抗體A/C購自santa cruz，微管 蛋白抗體購自abmart):用TBST稀釋一抗，室溫孵育1 Omin，放4°C過夜。第二天從4°C拿出膜， 在室溫孵育30min。
[0043] 洗膜:TBST洗膜5次，每次1 Omin。
[0044] e.二抗孵育：用5 %脫脂奶粉-TBST稀釋二抗（山羊抗兔I gG (H+L) HRP或山羊抗小鼠 IgG(H+L)HRP) 1:5000，室溫輕搖 40min。洗膜:TBST洗膜6 次，每次 3min。
[0045] f.曝光:ECL(Thermo)加到膜上后反應2min，膠片曝光：10s-5min(曝光時間隨不同 光強度而調整），顯影2min，定影。晾片，掃描等后續分析。
[0046] 所得結果如圖2所示，圖2顯示在RAW264.7細胞系中針對c-Rel的siRNA (簡稱 siRel)可顯著降低c-Rel的表達量。
[0047]同時，本實施例采用試劑盒（碧云天的分離試劑，貨號為P0028)分離上述已攝取 Cy5-siRNA的RAW264.7細胞的細胞質與細胞核，具體步驟參照試劑盒說明書進行，分離后的 蛋白組分通過Western Blot進行檢測，其中微管蛋白作為細胞質組分的內參，核纖維蛋白 A/C作為細胞核組分的內參。
[0048] Western Blot具體實驗步驟如前所述。
[0049] 所得結果如圖3所示，從圖3中可以看出細胞核內和細胞質內的c-Rel表達量都有 所降低。
[0050] 實施例2體內驗證實驗
[0051] 本實施例通過構建小鼠 EAE模型來進行體內治療效果的評估。具體地步驟如下所 述：
[0052] a.動物準備:研究中用到的小鼠飼養和實驗操作全部按照國家有關標準進行，所 有的外科操作都在無菌條件下進行；
[0053] b ·尾靜脈注射PT( 100ng/200yl/只）；
[0054] c.小動物麻醉(腹腔注射戊巴比妥鈉50mg/kg);
[0055] d.皮下注射M0G短肽（300yg/200ul/只）：背部皮下注射0.2mlM0G乳化液，分成2個 點注射（下背部左右各一個點），每個點〇 . lml。0.2mlM0G乳化液的成分為：0 . lmlMOG溶液 (0·15mg/ml)+0.lmlCFA(含4mg/ml M.tuberculosis);
[0056] e.尾靜脈注射PT:皮下注射48小時之后，再次注射PT;
[0057] f.腹腔注射給藥:將小鼠分為四組，未建模組不做處理，建模組一組作為對照，一 組注射納米粒子攜帶陰性對照siRNA(記為EAE(納米粒子+NC)，該陰性對照siRNA為上海吉 瑪公司提供的通用陰性對照siRNA)，還有一組注射納米粒子攜帶c-Rel siRNA組(記為EAE (納米粒子+siRNA)，該siRNA的正義鏈的序列為CAACCGGACAUACCCGUCUTT，反義鏈的序列為 AGACGGGUAUGUCCG⑶UGTT，且該正義鏈及反義鏈中的所有帶U或C堿基的核苷中的2 '位羥基 被甲氧基取代，該siRNA由上海吉瑪基因公司按常規方法合成），從建模第4天開始隔天給 藥，第15天將老鼠處死進行實驗；
[0058]對步驟f中的腦和脊髓組織切片進行常規的H&E染色，染色結果如圖4所示，圖4中 上一行是腦組織切片，下一行是脊髓組織切片，從圖4中可以看出治療組小鼠腦和脊髓內浸 潤的炎性細胞明顯減少。
[0059]最后說明的是：以上實施例僅用于說明本發明的實施過程和特點，而非限制本發 明的技術方案，盡管參照上述實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應 當理解:依然可以對本發明進行修改或者等同替換，而不脫離本發明的精神和范圍的任何 修改或局部替換，均應涵蓋在本發明的保護范圍當中。
【主權項】
1. 針對C-Rel的拮抗劑在制備用于預防和/或治療由炎癥引起的疾病的藥物中的應用。2. 根據權利要求1所述的應用，其中，所述由炎癥引起的疾病包括自身免疫性疾病或移 植排斥反應，優選地，所述自身免疫性疾病為多發性硬化癥。3. 根據權利要求1或2所述的應用，其中，所述針對c-Rel的拮抗劑為降低c-Rel表達水 平的試劑，優選地，所述試劑為siRNA。4. 根據權利要求3所述的應用，其中，所述siRNA包含經修飾或未經修飾的如SEQ ID N0:1、SEQIDN0:2所示的序列，該修飾是指SEQIDN0:1或SEQIDN0 :2中帶U或C堿基的核 苷的2'位羥基各自獨立地被甲氧基取代，優選SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2中帶U或C堿基的 核苷中的2 '位羥基均被甲氧基取代； 優選地，所述siRNA序列為經修飾或未經修飾的如SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4所示的序 列；該修飾是指SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中帶U或C堿基的核苷中的2'位羥基各自獨立地 被甲氧基取代，優選SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4中帶U或C堿基的核苷中的2'位羥基均被甲 氧基取代。5. -種拮抗c-Rel的siRNA，該siRNA包含經修飾或未經修飾的如SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2所示的序列，該修飾是指SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2中帶U或C堿基的核苷的2'位羥基 各自獨立地被甲氧基取代;優選SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2中帶U或C堿基的核苷中的2'位 羥基均被甲氧基取代； 優選地，所述siRNA序列為經修飾或未經修飾的如SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4所示的序 列，該修飾是指SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中帶U或C堿基的核苷中的2'位羥基各自獨立地 被甲氧基取代，優選地，SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4中帶U或C堿基的核苷中的2'位羥基均 被甲氧基取代。6. -種拮抗c-Rel的藥物組合物，所述組合物包含有效劑量的權利要求5所述的拮抗c-Rel的siRNA，以及藥學上可接受的載體;優選地，所述藥物組合物為包含有效劑量的所述 siRNA的納米膠束。7. 根據權利要求6所述的拮抗c-Rel的藥物組合物，其中，所述納米膠束的載體為PEG-PLL-PLLeu三嵌段共聚物；優選地，所述PEG-PLL-PLLeu三嵌段共聚物中PEG、PLL及PLLeu的 摩爾比例為 1:15 ~30:20 ~40;例如 1:15:20、1:30:40、1:20:30、1:30:20或 1:20:20。8. 根據權利要求7所述的藥物組合物，其中，所述三嵌段共聚物與所述siRNA的質量比 為85~115:6~10。9. 權利要求5所述的拮抗c-Re 1的s i RNA或權利要求6~8中任一項所述的藥物組合物在 制備預防和/或治療由炎癥引起的疾病的藥物中的應用。10. 根據權利要求9所述的應用，其中，所述由炎癥引起的疾病包括自身免疫性疾病或 移植排斥反應，優選地，所述自身免疫性疾病為多發性硬化癥。
【文檔編號】C12N15/113GK106086021SQ201610405099
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月8日
【發明人】萬曉春, 阮慶國, 張宏玲, 畢嘉成, 蔡林濤, 陳有海
【申請人】深圳先進技術研究院