肉桂醛在制備能夠誘導vegf表達和分泌的誘導劑中的用圖
【專利摘要】本發明涉及藥物領域，具體涉及肉桂醛在制備能夠誘導VEGF表達和分泌的誘導劑中的用途。本發明通過大量實驗研究，首次發現了肉桂醛能夠作為有效成分來誘導VEGF表達和分泌，能夠創造良好的經濟效益和廣泛的社會效益。
【專利說明】
肉桂醛在制備能夠誘導VEGF表達和分泌的誘導劑中的用途
[0001] 本申請是原申請的分案申請，原申請的申請日為：2014-5-22;申請號為： 20;發明創造名稱為：肉桂醛在制備促血管新生藥物中的應用。
技術領域
[0002] 本發明涉及藥物領域，具體涉及肉桂醛在制備能夠誘導VEGF表達和分泌的誘導劑 中的用途。
【背景技術】
[0003] 肉桂醛，英文名：Cinnamic aldehyde，分子式:C6H5CHCHCHo，分子量：132.16，CAS登 錄號：104-55-2，化學結構式為：
[0004]
[0005] 肉桂醛是一種醛類有機化合物，為黃色黏稠狀液體，天然存在于肉桂油、桂皮油、 藿香油、風信子油和玫瑰油等精油中。自然界中天然存在的肉桂醛均為反式結構，該分子為 一個丙烯醛上連接上一個苯基，因此可被認為是一種丙烯醛衍生物。
[0006] 最常用的肉桂醛合成方法是在近臨界水中，以苯甲醛和乙醛為原料，在無外加任 何催化劑的條件下，合成肉桂醛。天然肉桂醛可自肉桂油和桂皮油中，用亞硫酸氫鈉生成加 成物，再用堿分解分離，然后精制而得。
[0007]目前已公開的肉桂醛在醫藥方面的應用包括：1.殺菌防腐，特別是對真菌有顯著 療效。對大腸桿菌、枯草桿菌及金黃色葡萄菌、白色葡萄球菌、志賀氏痢疾桿菌、傷寒和副傷 寒甲桿菌、肺炎球菌、產氣桿菌、變形桿菌、炭疽桿菌、腸炎沙門氏菌，霍亂弧菌等有抑制作 用。且對革蘭氏陽性菌殺菌效果顯著，可用于治療多種因細菌感染引起的疾病。最小抑制濃 度(MIC)為0.02-0.07ul/ml，對深部致病真菌MIC為0.1 -0.3ul/ml。2.抗潰瘍，加強胃、腸 道運動。其作用機制是由于潰瘍活性因素（胃液與胃蛋白酶）的抑制與防御因素（胃粘膜血 流速率)的加強，以及抑制胃粘膜電位降低和對粘膜保護作用所致。除此之外，肉桂醛能降 低胰酶活性。肉桂醛系芳香性健胃驅風劑，對腸胃有緩和的刺激作用，可促進唾液及胃液分 泌，增強消化功能，解除胃腸平滑肌痙攣，緩解腸道痙攣性疼痛，有顯著的健胃、驅風效果。 3.脂肪分解作用。肉桂醛具有抑制腎上腺素及ACTH對脂肪酸的游離，促進葡萄糖的脂肪合 成作用，可用于血糖控制藥中，加強胰島素替換葡萄糖的性能，防治糖尿病。4.抗病毒作用。 對流感病毒，SVlO病毒引起的腫瘤抑制作用強大。5.抗癌作用。可抑制腫瘤的發生，并具抗 誘變和抗輻射作用。6.降壓作用。對腎上腺皮質性高血壓有降壓作用。7.壯陽作用。美國芝 加哥治療研究中心的一份研究表明，肉桂醛對男性壯陽有一定的功效。
[0008] 但是，目前關于肉桂醛在誘導VEGF表達和分泌方面的作用未見報道。

【發明內容】

[0009] 本發明的目的在于公開肉桂醛作為促進血管新生有效成分在制備血管新生促進 劑中的新用途，并基于肉桂醛新用途的發現，提供了通過促進血管新生產生治療作用的藥 物。
[0010] 本發明第一方面公開了肉桂醛作為促進血管新生有效成分在制備血管新生促進 劑中的新用途。
[0011] 進一步的，所述血管新生促進劑起到下列作用中的一種或多種：
[0012] a)促進內皮細胞增殖；
[0013 ] b)促進內皮細胞損傷愈合；
[0014] c)促進內皮細胞迀移；
[0015] d)促進內皮細胞管腔形成；
[0016] e)誘導VEGF表達和分泌；
[0017] f)激活PI3K/AKT信號通路；
[0018] g)激活 c-Raf/MEK/Erkl/2 信號通路，和/或
[0019] h)促進傷口組織血管數目增加。
[0020] 本發明第二方面公開了肉桂醛在制備通過促進血管新生產生治療作用的藥物中 的用途。
[0021] 進一步的，所述藥物為促進傷口愈合和/或創傷愈合和/或創面愈合的藥物。
[0022]優選的，所述藥物為治療皮膚急性傷口、皮膚慢性創傷或皮膚潰瘍的藥物。
[0023]更優選的，所述藥物為預防和/或治療糖尿病引起的皮膚損傷的藥物。
[0024] 進一步的，所述藥物為促進側枝血管形成的藥物。
[0025] 優選的，所述藥物為預防和/或治療冠心病心肌缺血的藥物。
[0026]本發明第三方面還公開了通過促進血管新生產生治療作用的藥物組合物，所述藥 物的有效成分中含有肉桂醛。
[0027] 優選的，上述藥物組合物中，肉桂醛為該藥物組合物的唯一有效成分。
[0028] 優選的，上述藥物組合物中還包含藥學上可接受的載體。
[0029] "藥學上可接受的"成分是適用于人和/或動物而無過度不良副反應(如毒性、刺激 和變態反應)即有合理的效益/風險比的物質。"藥學上可接受的載體"是用于將本發明的肉 桂醛傳送給動物或人的藥學上或食品上可接受的溶劑、懸浮劑或賦形劑。載體可以是液體 或固體。
[0030] 藥學上可接受的載體為各種藥學上常用的輔料和/或賦形劑，包括(但不限于)糖 類(如乳糖、葡萄糖和蔗糖），淀粉(如玉米淀粉和土豆淀粉），纖維素及其衍生物(如羧甲基 纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素），黃蓍膠粉末，麥芽，明膠，滑石，固體潤滑劑(如硬脂 酸和硬脂酸鎂），硫酸鈣，植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油，多元 醇（如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇），海藻酸，乳化劑(如Tween、聚氧乙烯 蓖麻油），潤濕劑(如月桂基硫酸鈉），著色劑，調味劑，壓片劑、穩定劑，抗氧化劑，防腐劑，無 熱原水，等滲鹽溶液和磷酸鹽緩沖液等;該載體可根據需要提高配方的穩定性、活性及生物 有效性等。
[0031] 本發明藥物組合物使用時，所述肉桂醛作為唯一有效成分，或者所述肉桂醛作為 有效成分之一，可與一種或多種藥學上可接受的載體或賦形劑混合制成不同給藥途徑的藥 物劑型。
[0032] 優選的，所述藥物組合物的制劑形式為片劑、膠囊、散劑、顆粒劑、糖漿劑、溶液劑、 口服液、醑劑、酊劑、氣霧劑、粉霧劑、注射劑、注射用無菌粉末，或者栓劑。上述制劑類型可 以按照藥劑學(第六版，人民衛生出版社，崔福德）中的相關定義理解，上述制劑的制備可以 按照藥劑學(第六版，人民衛生出版社，崔福德）中的相關制劑的方法配制。
[0033] 優選的，所述藥物組合物的制劑形式為片劑或口服液。
[0034] 優選的，本發明所述藥物組合物可經過口服、靜脈內、肌內或皮下途徑給藥。
[0035] 優選的，本發明的藥物組合物生產時可以通過濾膜過濾除菌，或者進行高壓滅菌。
[0036] 肉桂醛作為活性成分的有效劑量可隨給藥模式和疾病的嚴重程度而變化。對大部 分大型哺乳動物而言，每天有效成分肉桂醛的服用劑量約為0.01~l〇〇〇mg。優選的，成人臨 床給藥量的范圍為0.01-200mg/日，更優選為0.05-100mg/日。
[0037] 本發明的藥物具有明顯的促進血管新生的作用，可用于多種原因引起的血管損傷 的治療。
[0038] 本發明的有益效果為:本發明通過大量實驗研究，首次發現了肉桂醛作為有效成 分在制備血管新生促進劑中的新用途以及肉桂醛在制備通過促進血管新生產生治療作用 的藥物中的新用途。肉桂醛原料豐富，價格低廉，毒副作用小，劑型易于選擇，制劑成分明 確、制備工藝及其質量標準便于控制，具有良好的市場順應性和應用前景，能夠創造良好的 經濟效益和廣泛的社會效益。
[0039] 附圖標記
[0040] 圖1:肉桂醛對!1爪^08增殖的影響，林？〈0.01，*林？〈0.001￥8(3〇11廿〇1。
[0041 ]圖2:肉桂醛對HUVECs損傷愈合的影響，（A) (B)為劃痕實驗結果，（C)為爬片實驗結 果，**P〈0 · 01，***P〈0 · OOlvs control 〇
[0042] 圖 3:肉桂醛對HUVECs迀移的影響，a · controI，b · 0 · ΙμΜ，c · ΙμΜ，d · 5μΜ，e · 10μΜ，*** Ρ〈0.OOlvs control。
[0043] 圖4:肉桂醛對HUVECs管腔形成的影響，a · control，b · 0 · ΙμΜ，c · ΙμΜ，cL 5μΜ，e · 10μ Μ，***Ρ〈0.OOlvs control。
[0044] 圖5:肉桂醛對HUVECs分泌VEGF的影響，*#Ρ〈0·OOlvs control。
[0045] 圖6:肉桂醛促進AKT、eN0S蛋白磷酸化，**P〈0.05，**P〈0.01，***P〈0.001vs control〇
[0046] 圖7:肉桂醛促進c-Raf、Erkl/2、p38蛋白磷酸化。
[0047] 圖8:抑制劑對肉桂醛誘導的HUVECs增殖、VEGF分泌及AKT和Erkl/2蛋白磷酸化的 影響，***Ρ〈〇· 001 vs control，###Ρ〈0· 001 vs CA。
[0048] 圖9:野生型小鼠和糖尿病小鼠皮膚損傷后的傷口面積，Ρ〈0.05vs control。
[0049] 圖10:小鼠皮膚組織病理學切片(H&E染色），4X 10放大倍數。
[0050] 圖11:小鼠皮膚組織的CD-31免疫熒光切片，10\20放大倍數，林撲〈0.001" control ο
[0051] 圖12: VEGF在野生型小鼠（A)和糖尿病小鼠（B)皮膚組織中的表達，#*P〈0.OOlvs control〇
【具體實施方式】
[0052]下面結合具體實施例進一步闡述本發明，應理解，實施例僅用于說明本發明而不 用于限制本發明的保護范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分比和份數均按重量計。
[0053]實施例1肉桂醛促進血管新生體外實驗 [0054](一)實驗方法
[0055] 原代人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)購自美國ALLCELLs公司，每批細胞的純度均95% 以上，并采用流式細胞儀檢測內皮細胞相關標志物(⑶31，vWF，⑶54)的表達，陽性率均達到 99%以上，鑒定為原代細胞。
[0056] 1.肉桂醛促進HUVECs增殖實驗
[0057]取指數生長期的原代人臍靜脈內皮細胞(111^^(^)，用如0813完全培養基制成5乂 104個/ml細胞懸液，以5 X 103個/孔細胞密度接種到96孔板，置于37 °C、5 % C02培養箱中；待 細胞貼壁良好以后，棄原培養基，換含1 % FBS和不同濃度肉桂醛(購于中國藥品生物制品檢 定所公司，純度為98%以上）的基礎培養基;對照組為含等量DMSO的不含藥培養基，陽性對 照組為加入VEGF(20ng/ml)的不含藥培養基;24小時后，加入CCK-8溶液（10μ1/孔），在培養 箱中反應3小時，選取450nm波長在酶標儀上檢測各孔吸光度值(0D值）；增殖率％ = (0D給 藥/OD對照-I) X 100%。
[0058] 2.肉桂醛促進HUVECs損傷愈合實驗
[0059] 在24孔板中加入0.5%明膠(400μ1/孔），置于37°C、5%C02培養箱中孵育至少2小 時后，棄明膠，晾干備用;取指數生長期的原代人臍靜脈內皮細胞(HUVECs )，用MCDBl 31完全 培養基制成I X 105個/ml細胞懸液，以3 X 104個/孔細胞密度接種到明膠包被的24孔板，置 于37°C、5%C02培養箱中；待細胞貼壁良好以后，用200μ1槍頭在每孔中間位置垂直劃一道 直線，棄原培養基，PBS洗掉漂浮的細胞(洗2次即可），換含1%FBS和不同濃度肉桂醛的基礎 培養基;分別TO和T24時間點在同一位置于100倍顯微鏡下拍照，記錄劃痕距離;愈合率％ = (1-T24劃痕距離/TO劃痕距離）XlOO^j.爬片實驗評價肉桂醛促進HUVECs損傷愈合的能 力
[0060] 在12孔板中每孔放入一片直徑為13mm的圓形塑料蓋玻片，加入0.5%明膠(800μ1/ 孔），置于37°C、5%C02培養箱中孵育至少2小時后，棄明膠，晾干備用;取指數生長期的原代 人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)，用M⑶Bl31完全培養基制成I X 105個/ml細胞懸液，以3 X 104 個/孔細胞密度接種到明膠包被的24孔板，置于37 °C、5 % C02培養箱中；24小時后，用無菌鑷 子把每孔中的蓋玻片輕輕夾出來，棄原培養基，換含1%FBS和不同濃度肉桂醛的基礎培養 基;24小時后，按照細胞消化的方法將每孔細胞消化下來分別移至1.5ml離心管中，輕輕混 勻，用血細胞計數儀記錄每孔細胞數；用細胞數的多少來評價肉桂醛促進HUVECs損傷愈合 的能力。
[0061 ] 4.肉桂醛促進HUVECs迀移實驗
[0062] 24孔板中每孔加入600μ1下室培養基（MCDB131基礎培養基+50ng/ml VEGF+10% FBS)，將Transwe11小室放入24孔板中；取指數生長期的原代人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)， 用MCDB131基礎培養基制成5 X 105個/ml細胞懸液，以5 X 104個/孔細胞密度接種Transwell 小室中，加入不同濃度的肉桂醛，置于37 °C、5 % C02培養箱中；24小時后，在一塊干凈的24孔 板中加入I3BS 600μ1/孔，將小室轉移至新24孔板中，用小棉球輕輕擦拭小室上表面(注：力 度要輕以免膜表面不平）；用1〇μΜ Hochest33258染色10分鐘(室溫，避光）；再取出另一塊干 凈的24孔板，加入4%多聚甲醛600μ1/孔，細胞固定15分鐘；于40倍熒光顯微鏡下每孔隨機5 個視野拍照;利用IPP圖像分析軟件計算每張圖片的細胞數并進行統計分析。
[0063] 5.肉桂醛促進HUVECs管腔形成實驗
[0064] 將96孔板和200μ1無菌槍頭在-20°C條件下預冷2小時，Matrigel膠4 °C解凍。在無 菌條件下，吸取Matrigel膠于96孔板中（50μ1/孔，避免產生氣泡），置于37°C、5 %C02培養箱 中1小時，待膠凝固后備用；取指數生長期的原代人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)，用MCDB131基 礎培養基制成5 X 105個/ml細胞懸液，以5 X 104個/孔細胞密度接種于Matrigel膠包被的96 孔板中，加入不同濃度的肉桂醛，置于37°C、5%C02培養箱中；4小時后，每孔隨機選取5個視 野于40倍顯微鏡下拍照，利用Image pr〇-plUS(IPP)圖像分析軟件計算每張圖片的管腔數 目并進行統計分析。
[0065] 6.酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測肉桂醛誘導VEGF釋放
[0066] 取指數生長期的原代人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)，用M⑶B131完全培養基制成I X 105個/ml細胞懸液，以3 X 104個/孔細胞密度接種到24孔板，置于37 °C、5 % C02培養箱中；待 細胞貼壁良好后，棄原培養基，換含1%FBS和不同濃度肉桂醛的基礎培養基，對照組為含等 量DMSO的不含藥培養基，分別在0、24、36、48、72小時收集細胞上清，4°(：，1500印111離心15分 鐘，取上清于-20°C保存待測。檢測方法參考試劑盒操作說明，所述試劑盒為Human VEGF ELISA試劑盒(eBioscience公司）。
[0067] 7. Western-Blot方法檢測肉桂醛誘導HUVECs各蛋白表達
[0068]取對數生長期的原代人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)，用MCDB131完全培養基制成1.5 X 105個/ml細胞懸液，以3 X 105個/孔細胞密度接種到6孔板，置于37 °C、5 % C02培養箱中； 待細胞貼壁良好后，棄原培養基，換含I %FBS的基礎培養基饑餓兩個小時，再加入不同濃度 藥物，分別作用不同時間后提取蛋白；棄原培養基，馬上用預冷的PBS洗滌細胞兩次，最后將 殘液完全吸凈，加入裂解液(90μ1/孔），冰上放置15分鐘(每隔5分鐘震搖培養板一次以便細 胞裂解完全）；將裂解勻漿收集于1.5ml EP管中，4°C，12000rpm離心10分鐘，取上清;取少量 蛋白用于蛋白濃度測定，其余大部分蛋白加入上樣緩沖液，煮沸5分鐘變性，于-20°C保存待 測。以每孔等量蛋白上樣于10 % SDS-PAGE，電泳分離后將蛋白轉至PVDF膜，用相應的單克隆 抗體檢測，以β-act in作為內參。實驗結果以目標蛋白與β-act in蛋白表達量比值表示。 [0069](二)實驗結果 [0070] 1.肉桂醛對HUVECs增殖的影響結果
[0071]肉桂醛能夠顯著地誘導HUVECs增殖，加藥處理24小時后，采用CCK-8法檢測細胞增 殖情況并計算細胞增殖率。結果如圖IA顯示，肉桂醛可呈濃度依賴性地促進HUVECs增殖，在 ΙΟμΜ時增殖率達到33%。繼而進一步觀察肉桂醛是否呈時間依賴性地促進HUVECs增殖，結 果如圖1Β，活細胞數目可隨時間（6~24小時）依次增加。以上實驗結果如圖顯示，肉桂醛呈 現時間和濃度依賴性的促進內皮細胞增殖。
[0072] 2.肉桂醛對HUVECs損傷愈合的影響結果
[0073] 細胞劃痕結果如圖2A和圖2B顯示，加藥處理受損細胞24小時后，肉桂醛在Ο.ΙμΜ時 能夠顯著地促進細胞損傷愈合，愈合率達到54.1 %，而此時對照組則僅為40.4% ;當ΙΟμΜ濃 度時，損傷細胞已經完全愈合。細胞爬片實驗進一步證明肉桂醛的這一能力，如圖2C所示， 肉桂醛于IyM可顯著提高細胞數量，為對照組的1.15倍。提示，肉桂醛能夠誘導內皮細胞損 傷愈合且呈濃度依賴性。
[0074] 3.肉桂醛對HUVECs迀移的影響結果
[0075]內皮細胞迀移是促進血管形成因子和抑制血管形成因子相互作用的復雜的過程， 其表現了細胞的運動能力。結果如圖3所示，與對照組相比，肉桂醛可顯著地誘導HUVECs迀 移，在濃度為〇. I，1，5和ΙΟμΜ時，迀移到膜下的細胞數分別為22，28，35，33個/視野。提示肉 桂醛能夠誘導內皮細胞迀移。
[0076] 4.肉桂醛對HUVECs管腔形成的影響結果
[0077] 體外血管新生主要通過內皮細胞增殖、迀移及管腔形成等幾個步驟，管腔形成是 其中最為關鍵的一步。如圖4所示，與對照組相比，肉桂醛可顯著地誘導HUVECs管腔形成，于 ΙΟμΜ時，管腔結構數目比對照組增加35% (P〈0.001)。提示肉桂醛能夠促進內皮細胞管腔結 構形成并呈現濃度依賴關系。
[0078] 5.肉桂醛誘導HUVECs分泌VEGF
[0079] VEGF是重要的促血管生成因子，在血管新生過程中發揮了關鍵的調控作用。ELISA 檢測結果顯示(如圖5)，肉桂醛呈現時間和濃度依賴性的誘導內皮細胞分泌VEGFA.肉桂醛 對PI3Κ/ΑΚΤ信號通路的影響結果
[0080] ΡΙ3Κ/ΑΚΤ是血管新生過程中一條重要的信號通路，主要維持內皮細胞生存與增 殖。肉桂醛對HUVECs胞內PI3Κ/ΑΚΤ信號通路的影響結果顯示，肉桂醛誘導AKT及其下游蛋白 eNOS磷酸化呈現時間和濃度依賴關系。如圖6Β所示，肉桂醛于5分鐘時誘導AKT磷酸化直至 120分鐘。同時其可誘導AKT下游信號分子eNOS于5分鐘時磷酸化直至60分鐘（圖6D)。如圖6A 和圖6C所示，隨著肉桂醛濃度的增加（1~10μΜ)，AKT、eNOS的磷酸化水平依次提高。提示肉 桂醛能夠顯著性地激活PI3K/AKT信號通路。
[0081 ] 7.肉桂醛對MAPK信號通路的影響結果
[0082]血管新生的另一條主要通路為MAPK信號通路，其包括:Erkl/2信號通路、p38信號 通路和JNK/SPAK信號通路。如圖7B和圖7D所示，肉桂醛于5分鐘顯著誘導c-Raf磷酸化直至 120分鐘，而微弱誘導c-Raf下游信號分子Erkl/2直至120分鐘。同時，隨著肉桂醛濃度的增 加（1~1(^)，(：-1^』41/2的磷酸化水平依次提高（圖74和圖7〇。如圖8?所示，肉桂醛于5 分鐘顯著誘導P38磷酸化直至120分鐘。然而其磷酸化水平并未因濃度的增加而改變（圖 7E)。對于JNK/SAPK信號通路，肉桂醛對其沒有任何影響。提示肉桂醛能夠顯著性地激活C-Raf/MEK/Erkl/2 信號通路。
[0083] 8.PI3K/AKT和Raf/MEK/Erkl/2信號通路參與肉桂醛調節體外血管新生過程
[0084] 為進一步證明PI3K/AKT和Raf/MEK/Erkl/2信號通路與肉桂醛調節體外血管新生 過程相關，我們采用PI3K抑制劑LY294002和MEK抑制劑U0126,觀察其對肉桂醛誘導體外血 管新生的影響。如圖8A和圖8B所示，LY294002和U0126能夠明顯抑制HUVECs增殖和分泌 VEGF。同時，圖8C和圖8D顯示，LY294002和UO126可抑制HUVECs管腔形成。此外，如圖8E所示， LY294002可阻斷肉桂醛誘導AKT磷酸化而對肉桂醛誘導Erkl/2磷酸化沒有影響。如圖8F所 示，U0126可阻斷肉桂醛誘導Erkl/2磷酸化而對肉桂醛誘導AKT磷酸化沒有影響。由以上結 果得出，PI3K/AKT和Raf/MEK/Erkl/2信號通路與肉桂醛調節體外血管新生過程相關，但兩 條通路之間并沒有直接的相互介導作用。
[0085] 實施例2肉桂醛促進血管新生體內實驗
[0086] ( - )實驗方法
[0087] 1.實驗動物
[0088]野生型（C57BL/6)小鼠，雄性，體重 18-22g;糖尿病型（BSK · Cg-m+/+L印rdb; db/db) 小鼠，雄性，體重55-60g，血糖值27.3 ± 0.6mmol/L，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公 司。
[0089] 2.動物模型建立
[0090] 小鼠經戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，用寵物剃毛器逆毛方向背部剃毛，大約露出 4cm見方大小的皮膚(盡量把毛剃到最短，但不能傷及皮膚），隨后均勻涂抹脫毛膏在空白皮 膚處，2分鐘后，用酒精棉球擦拭，以便除凈小鼠背部的毛;利用消毒后的角膜環鉆在小鼠背 部打一圓孔，切取8_直徑大小的圓形皮膚，即形成皮膚損傷模型。
[0091] 3.動物分組及給藥
[0092] 分別將造模后的64只C57小鼠和64只db/db小鼠均隨機分為4組，每組16只，分別為 100mg/kg肉桂醛給藥組(高劑量組）、50mg/kg肉桂醛給藥組（中劑量組）、25mg/kg肉桂醛給 藥組(低劑量組）、生理鹽水組(對照組）；將小鼠分籠喂養(4只/籠），每天腹腔注射給藥。
[0093] 4.取材
[0094] 分別于給藥后第6天和第12天，每組隨機挑選四只小鼠脫頸處死，切取傷口組織， 將其平均分配成兩個部分:一部分用于免疫組織學實驗，置于4%多聚甲醛中固定；另一部 分用于免疫印跡實驗，_80°C保存。
[0095] 5.指標檢測
[0096] (1)傷 口直徑
[0097]隔天給小鼠背部傷口拍照，利用Image J圖像分析軟件測量傷口直徑大小并計算 損傷愈合率。愈合率（％ ) = (1-第η天傷口直徑大小/第0天傷口直徑大小）X 100% (η為拍照 當天）。
[0098] (2)免疫印跡法測損傷組織VEGF蛋白表達
[0099]稱取-80°C凍存的皮膚組織，盡可能剪成小碎塊，裝入1.5mlEP管中，按比例加入組 織蛋白裂解液(含有蛋白酶抑制劑），用電動組織勻漿儀將其研碎（冰上操作，以防蛋白變 性）；4°C，12000rpm離心10分鐘，吸取上清，取少量蛋白用于蛋白濃度測定，其余大部分蛋白 加入上樣緩沖液，煮沸5分鐘變性，于-20 °C保存待測。以每孔等量蛋白上樣于10 % SDS-PAGE，電泳分離后將蛋白轉至PVDF膜，用相應的單克隆抗體檢測，以β-actin作為內參。實驗 結果以目標蛋白與β-actin蛋白表達量比值表示。
[0100](二)實驗結果
[0101 ] 1.肉桂醛加速小鼠皮膚傷口愈合實驗
[0102]血管新生是傷口愈合過程中一個關鍵的環節，而傷口愈合不良是糖尿病的嚴重并 發癥之一，其根本原因是由于血管新生不充足。本實驗分別對肉桂醛是否能夠促進野生型 小鼠和糖尿病小鼠皮膚損傷愈合進行考察。結果顯示，野生型小鼠皮膚傷口愈合速度（12 天）明顯高于糖尿病小鼠（22天）。當腹腔注射肉桂醛后，小鼠皮膚傷口愈合速度顯著提高。 野生型小鼠皮膚傷口在給藥10天后達到完全愈合，而糖尿病小鼠則需要16天。對于野生型 小鼠，在給藥第4天，加藥組的傷口面積明顯比對照組小。如圖9A所示，低劑量組傷口愈合率 (47 % )與對照組(36 % )相比(P〈0.01)，中劑量組(58 % )與對照組(36 % )相比(P〈0.001)，高 劑量組(59 % )與對照組(36 % )相比(P〈0.001)。而對于糖尿病小鼠（圖9B)，在第4天，低劑量 組與對照組傷口愈合率無顯著性差異，中劑量組(49%)與對照組（18%)相比(P〈0.001)，高 劑量組(50 % )與對照組（18 % )相比(P〈0.001)。
[0103] 2.組織學觀察小鼠皮膚傷口愈合情況
[0104] 為更好的證明肉桂醛加速小鼠皮膚傷口愈合的活性，本實驗采用H&E染色觀察小 鼠皮膚傷口愈合的組織學效應。如圖10,第10天病理組織切片顯示，糖尿病對照組小鼠皮膚 缺損面積仍然很大，僅有少量表皮覆蓋且連續性較差，有大量的肉芽組織存在;而野生型對 照組小鼠皮膚缺損面積很小，大量表皮覆蓋，可見瘢痕組織，有少量的肉芽組織。給予肉桂 醛以后，糖尿病小鼠傷口表皮基本覆蓋但較薄，仍有肉芽組織存在;而野生型小鼠傷口完全 修復，肉芽組織消失。結果顯示，肉桂醛能夠良好地修復小鼠皮膚傷口愈合過程。
[0105] 3.肉桂醛對小鼠皮膚傷口組織血管新生的影響
[0106] 為觀察肉桂醛是否能夠促進小鼠皮膚傷口組織血管新生，本實驗采用免疫熒光的 方法檢測血管壁上⑶31抗原，從而顯示傷口組織的血管新生。如圖11所示，在第10天，野生 型小鼠傷口組織血管數目（56個/視野）明顯多于糖尿病小鼠（33個/視野）（P〈0.05)。而給予 肉桂醛以后傷口組織血管數目明顯增多，野生型小鼠和糖尿病小鼠傷口組織血管數目分別 為166個/視野和156個/視野。以上結果顯示，肉桂醛可促進野生型小鼠和糖尿病小鼠皮膚 傷口組織血管新生。
[0107] 4.肉桂醛對小鼠皮膚傷口組織VEGF蛋白表達的影響
[0108] 體外實驗結果表明肉桂醛可促進HUVECs分泌VEGF，繼而采用動物模型觀察肉桂醛 是否能夠誘導小鼠皮膚傷口組織VEGF蛋白的表達。如圖12所示，生理鹽水對照組小鼠皮膚 傷口組織VEGF表達量高于未受損皮膚組織，提示創傷后的皮膚組織本身會分泌VEGF。當給 予肉桂醛后，小鼠傷口組織VEGF表達量均明顯升高。結果顯示，肉桂醛促進小鼠皮膚傷口愈 合與其誘導VEGF蛋白的表達上調相關。
[0109] 實施例3實驗總結
[0110] 綜上所述，本發明通過建立原代人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)體外培養體系評價了 不同濃度的肉桂醛對內皮細胞增殖活性的影響。
[0111] 1.分別采用CCK-8增殖實驗、細胞劃痕與爬片實驗、Transwell迀移實驗及體外成 管實驗檢測肉桂醛誘導體外血管新生的活性。結果顯示，肉桂醛于0.01~1〇〇μΜ濃度時可誘 導HUVECs增殖、損傷愈合、迀移以及管腔形成，并呈現一定的量效關系。
[0112] 2.利用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定HUVECs培養上清中分泌的血管內皮生長因子 (VEGF)的含量，結果發現，肉桂醛能夠于24~48小時誘導VEGF的分泌量顯著增加。
[0113] 3.蛋白免疫印跡法(Western-blot)檢測結果顯示，肉桂醛能夠激活磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/AKT和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen- activatedproteinkinases，MAPK)兩條信號通路，可呈時間和濃度依賴性地上調其中的主 要革巴蛋白：AKT、內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)、胞外 信號調節激酶（extracellular regulated protein kinasesl/2，Erkl/2)、c_Raf、p38激酶 (?381^1^86，？38);此外，？131(和]\^1(特異性抑制劑1^294002和1]0126能夠阻斷肉桂醛誘導 AKT和Erkl/2的磷酸化，并且抑制內皮細胞增殖、管腔形成及VEGF的分泌。
[0114] 4.本發明還采用野生型小鼠和糖尿病小鼠皮膚損傷模型，對肉桂醛促血管新生作 用的藥效進行了體內驗證。結果發現，與對照組相比，每天分別腹腔注射肉桂醛10~IOOmg/ kg后，小鼠皮膚傷口明顯縮小(P〈0.05)。此外，肉桂醛可通過升高傷口組織VEGF蛋白的表達 量并誘導傷口周圍組織新血管的形成，從而誘導皮膚損傷愈合，并證實其對小鼠本身沒有 毒副作用。同時對糖尿病小鼠血糖水平的監測結果表明，肉桂醛誘導糖尿病小鼠皮膚損傷 愈合并不依賴于血糖值的變化。
[0115] 由此可見，肉桂醛在0.01~IOOyM濃度范圍內能夠顯著誘導體外血管新生，并于10 ~100mg/kg劑量時加速小鼠皮膚損傷愈合，其作用機制可能與激活ΡΙ3Κ/ΑΚΤ和MAPK信號通 路相關。
[0116] 實施例4肉桂醛在制備藥物中的新用途
[0117] 本發明通過大量實驗研究，發現肉桂醛可用于：
[0118] a)促進內皮細胞增殖，
[0119] b)促進內皮細胞損傷愈合，
[0120] c)促進內皮細胞迀移，
[0121] d)促進內皮細胞管腔形成，
[0122] e)誘導VEGF表達和分泌，
[0123] f)激活PI3K/AKT信號通路，
[0124] g)激活 c-Raf/MEK/Erkl/2 信號通路，和/或
[0125] h)促進傷口組織血管數目增加。
[0126] 因此，肉桂醛在制備促血管新生相關藥物中的新用途包括：
[0127] 第一，制備傷口愈合/創傷愈合/創面愈合藥物
[0128] 創傷愈合包括細胞增殖、迀移及胞外基質沉積等復雜的生物學及分子學過程，其 需要良好的動態循環系統、充足的營養，并盡可能避免機械外力的傷害，此過程的順利完成 通常需要3到14天，一般分為三個階段:炎癥階段、增殖階段、組織重構階段。新血管的形成 主要發生在增殖階段，首先成纖維細胞產生膠原基質，隨之新生成的血管入侵肉芽組織，最 后表皮細胞迀移到損傷表面封閉裂痕組織。眾所周知，血管新生是傷口愈合過程的關鍵階 段，新生的血管可為受損組織的生長傳輸足夠的氧氣與營養，同時排泄組織周圍細胞代謝 所產生的副產物。恢復受損區域的血流量有利于損傷組織的修復，并且皮膚損傷愈合過程 易于控制與處理，因此它將是血管新生研究的最理想模型。
[0129] 慢性創傷是世界上嚴重的臨床疾病之一，其具有較高的發病率卻往往缺乏較好的 治療手段。它是一種阻斷皮膚連續性和組織完整性的疾病，達到完全愈合需要很長的一段 時間（至少8周），甚至不能愈合或者再次復發。創傷愈合受損將直接導致皮膚潰瘍，是一種 嚴重的糖尿病并發癥，稱之為"糖尿病足"，其原因可能是血管新生不足。據估計，多達兩百 萬美國人都患有下肢傷口不愈疾病。根據疾病控制和預防中心報道，即使在創傷治療方面 已經有所進步，但頑固性創傷仍然導致每年有72000糖尿病人面臨截肢。21世紀的今天，糖 尿病足每年的增長率在1 %到4.1 %之間，而截肢增長率在0.21 %到0.37%之間。因此，探究 有效的治療手段來攻克因血管新生不足而導致的慢性創傷是目前研究者們的首要任務。 [0130]第二，制備冠心病心肌缺血治療藥物
[0131] 冠心病是在諸如高血壓、高血脂癥、吸煙、糖尿病、不良飲食習慣和缺乏運動等多 種危險因素的作用下，冠狀動脈發生并形成粥樣硬化病灶，使得管狀動脈腔徑狹小或阻塞， 而引起心肌缺血缺氧直至心肌細胞死亡的嚴重疾病。目前對冠心病心肌缺血的經典治療包 括：⑴藥物治療。擴張冠狀動脈，增加冠脈血供，如硝酸酯類藥物;減慢心率，降低血壓以減 少心肌氧旁路移植術耗，如β受體阻滯劑;抗血小板、抗凝治療，穩定粥樣硬化板塊，如低分 子肝素等。（2)介入治療。（3)外科治療。而促進缺血心肌區域側枝循環的建立健全和動脈血 管的新生，即治療性血管生成（therapeutic angiogenesis)，是目前國際心血管病學界的 研究熱點。治療性血管生成的定義是促進營養性側枝循環血管的生成，在業已阻塞或狹窄 的動脈周圍組成內生的旁路循環。它包括血管生成：指心肌內側枝循環血管（<200um)和毛 細血管(<20um)增多；以及動脈新生:指已狹窄或阻塞的心外膜冠狀動脈供血區域中新生成 較大的動脈血管（>200um) 〇
[0132] 心肌缺血或梗死的早期，毛細血管和毛細血管密度增加，內皮細胞或單核細胞活 化，隨后壞死的心肌細胞和浸潤的炎癥細胞釋放成血管性生長因子(Bfgf、VECF)、細胞因子 (MCP-1、IL-6、IL-8)，并且細胞間粘附因子(ICAM)表達的增加，導致內皮細胞和平滑肌細胞 有絲分裂增加，最終形成正常肌性動脈。冠脈阻塞后酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)mRNA 轉錄增加，aFGF有活化的單核細胞釋放，是內皮、結締組織和平滑肌細胞的強力有絲分裂 原，并能刺激內皮細胞分泌尿纖溶酶原。冠狀動脈內或靜脈注射重組堿性成纖維細胞生長 因子(bFGF)亦可加速側枝循環的建立。血管內皮生長因子(VEGF)是特異性血管內皮細胞有 絲分裂原，其mRNA存在于鄰近側枝血管重建或心肌細胞。冠狀動脈內注射VEGF可在漸進性 冠狀動脈阻塞4周后使側枝循環血流量增加40%。
[0133] 第三，制備糖尿病皮膚損傷預防/治療藥物
[0134] 發明還采用野生型小鼠和糖尿病小鼠皮膚損傷模型，對肉桂醛促血管新生作用的 藥效進行了體內驗證。結果發現，與對照組相比，每天分別腹腔注射肉桂醛10~l〇〇mg/kg 后，小鼠皮膚傷口明顯縮小(P〈〇. 05)。此外，肉桂醛可通過升高傷口組織VEGF蛋白的表達量 并誘導傷口周圍組織新血管的形成，從而誘導皮膚損傷愈合，并證實其對小鼠本身沒有毒 副作用。同時對糖尿病小鼠血糖水平的監測結果表明，肉桂醛誘導糖尿病小鼠皮膚損傷愈 合并不依賴于血糖值的變化。
[0135] 基于本發明實施例1和2的研究內容，肉桂醛是具有促進血管新生作用的一種活性 物質，本領域技術人員可知，對于通過血管新生手段能達到疾病康復或緩解的病理過程，如 上述傷口愈合、冠心病心肌缺血或糖尿病皮膚損傷，肉桂醛作為有效成分，在制備促血管新 生相關藥物方面具有重要的意義。
[0136] 以上所述，僅為本發明的較佳實施例，上述實施例僅例示性說明本發明的原理及 其功效，而并非對本發明任何形式上和實質上的限制，應當指出，對于本技術領域的普通技 術人員，在不脫離本發明方法的前提下，還將可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也 應視為本發明的保護范圍。凡熟悉本專業的技術人員，在不脫離本發明的精神和范圍的情 況下，當可利用以上所揭示的技術內容而做出的些許更動、修飾與演變的等同變化，均為本 發明的等效實施例；同時，凡依據本發明的實質技術對上述實施例所作的任何等同變化的 更動、修飾與演變，均仍屬于本發明的技術方案的范圍內。
【主權項】
1. 肉桂醛在制備能夠誘導VEGF表達和分泌的誘導劑中的用途。2. 根據權利要求1所述的用途，其特征在于，所述用途具體為：肉桂醛在制備能夠誘導 內皮細胞中VEGF表達和分泌的誘導劑中的用途。3. 根據權利要求1所述的用途，其特征在于，所述用途具體為：肉桂醛在制備能夠誘導 血管內皮細胞中VEGF表達和分泌的誘導劑中的用途。4. 根據權利要求1所述的用途，其特征在于，肉桂醛為所述誘導劑的唯一有效成分或多 個有效成分之一。
【文檔編號】A61P9/10GK106074468SQ201610387833
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2014年5月22日 公開號201610387833.7, CN 106074468 A, CN 106074468A, CN 201610387833, CN-A-106074468, CN106074468 A, CN106074468A, CN201610387833, CN201610387833.7
【發明人】詹常森, 周俊杰, 張衛東, 柳潤輝, 韓琳, 姜鵬, 黃昕明
【申請人】上海和黃藥業有限公司, 中國人民解放軍第二軍醫大學