二烯丙基二硫在制備生精細胞抗輻射損傷藥物中的應用
【專利摘要】本發明公開了二烯丙基二硫(DADS)在制備預防和/或治療輻射對睪丸組織的損傷的藥物中的應用。具體地，本發明明確了DADS能降低輻射對小鼠精子活力的影響，能有效對抗輻射對精子的損傷反應，能保護睪丸組織細胞中的部分蛋白質免受輻射的損傷，能有效對抗輻射對睪丸組織細胞脂質的損傷反應，能有效降低輻射對睪丸組織細胞核酸的損傷反應，對于預防和治療輻射對生殖系統的損傷具有顯著的意義。而且DADS低毒性，容易獲得，成本低，是脂溶性分子，易穿透血?腦屏障、血?睪屏障及血?氣屏障等生理性屏障，起到水溶性藥物難以到達的生理部位發揮作用，具有很好的應用前景。
【專利說明】
二烯丙基二硫在制備生精細胞抗輻射損傷藥物中的應用
技術領域
[0001] 本發明屬于生物醫藥技術領域。更具體地，涉及二烯丙基二硫在制備生精細胞抗 輻射損傷藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 隨著航天科技、核工業技術及核醫學的發展，相關職業人員、腫瘤病人及普通大眾 暴露于電離輻射的危險逐漸增大。電離輻射對機體造成的各種損傷反應中以骨髓抑制、肺 損傷、消化系統損傷、免疫系統損傷及生殖系統損傷最為嚴重。因此，針對這些電離輻射損 傷而進行的輻射防護研究變得越來越重要。除了影響受照射的本體以外，電離輻射通過對 生殖細胞的致畸作用還能影響其子代的生命活動。因此生殖系統輻射損傷的后期效應遠甚 于其他組織器官的輻射損傷。
[0003] 輻射防護劑是生物體受輻射前給予其某些化學藥物以減輕機體輻射損傷反應并 促進損傷組織恢復的藥物。輻射防護劑最常用于從事核工業技術的人員、航天工作者及腫 瘤放療的病人。盡管某些藥物具有輻射防護效果，但由于其毒性副作用的原因而并未用于 人體[Hall EJ. Radiobiology for Radiologist,4th ed.Philadelphia: Lippincott Co . 1994:165-190.]。在醫療領域，輻射防護劑積極用于腫瘤放療也并未受到足夠關注。因 此尋找毒性低、易被人們接受而具有輻射防護效應的藥物顯得至為關鍵。
[0004] 含硫有機物二烯丙基二硫(DADS)是大蒜素中的一種活性物質，淡黃色，溶于油而 不溶于水，分子式為C6H 1QS2,結構式為.·~分子量146.28。經研究表明，DADS對12C6+束 照射小鼠的肝臟組織具有輻射防護效應[許帥，張紅，劉陽，等.二烯丙基二硫對 12C6+離子束 輻照損傷小鼠的保護作用研究[J].原子核物理評論，2013,30(1) :79-83.]。大蒜是生活農 副產品，自古就被人們使用于食品添加劑。因此DADS用于輻射防護具有諸多優點：低毒性， 已被無數勞動者生活實踐證實；極易生產獲取，使用者眾多；脂溶性分子，易穿透血-腦屏 障、血-睪屏障及血-氣屏障等生理性屏障，起到水溶性藥物難以到達的生理部位發揮作用； 對于腫瘤放療病人最為重要的是，DADS對腫瘤具有輻射增敏效應而沒有輻射防護作用[許 帥，張紅，劉陽，等.二烯丙基二硫對荷S180肉瘤小鼠的輻射增敏效應[J].激光生物學報， 2013，22(3): 60-65.]。作為食物療法，DADS在輻射防護中的應用易被人們接受。
[0005] 但是，目前為止，關于DADS對睪丸組織的輻射防護效應研究目前尚未見文獻報道。

【發明內容】

[0006] 本發明要解決的技術問題是克服現有睪丸組織的輻射防護技術的不足，基于生殖 系統輻射防護的重要性，建立動物輻射損傷模型，通過觀察睪丸組織、精子的活力及形態， 檢測蛋白質、脂質及遺傳物質的損傷指標，探討DADS對雄性小鼠生精細胞的輻射防護作用。
[0007] 本發明的目的是提供二烯丙基二硫(DADS)在制備生精細胞抗輻射損傷藥物中的 應用。
[0008] 本發明上述目的通過以下技術方案實現：
[0009] 二烯丙基二硫(DADS)在制備預防和/或治療輻射對睪丸組織的損傷的藥物中的應 用。
[0010] 具體地，所述應用是指二烯丙基二硫在制備能夠降低輻射對精子活力的影響的藥 物中的應用。
[0011] 所述應用是指二稀丙基二硫在制備能夠對抗福射對精子的致畸作用的藥物中的 應用。
[0012] 所述應用是指二烯丙基二硫在制備能夠保護睪丸組織細胞中的蛋白質免受輻射 的損傷的藥物中的應用。
[0013] 所述應用是指二烯丙基二硫在制備能夠有效對抗輻射對睪丸組織細胞脂質的損 傷的藥物中的應用。
[0014] 所述應用是指二烯丙基二硫在制備能夠有效對抗輻射對睪丸組織細胞核酸的損 傷的藥物中的應用。
[0015] 另外，優選地，所述輻射是指X射線輻射。
[0016] 優選地，所述睪丸組織具體是指睪丸組織中的生精細胞和/或精子。
[0017] -種能夠預防和/或治療輻射對睪丸組織的損傷的藥物也在本發明的保護范圍之 內，所述藥物包含有二烯丙基二硫(DADS)。
[0018] 優選地，所述藥物還包括藥學上可接受的載體，可制備成不同的劑型。
[0019] 本發明具有以下有益效果：
[0020] 本發明公開了二烯丙基二硫對睪丸組織抗輻射損傷的應用，對于輻射對生殖系統 的損傷具有顯著的預防和治療作用，具有很好的應用前景和醫療意義。
[0021] 而且，DADS是大蒜素中的一種活性物質，大蒜是生活農副產品，自古就被人們使用 于食品添加劑，因此DADS用于輻射防護具有諸多優點:低毒性，已被無數勞動者生活實踐證 實;極易生產獲取，使用者眾多；脂溶性分子，易穿透血-腦屏障、血-睪屏障及血-氣屏障等 生理性屏障，起到水溶性藥物難以到達的生理部位發揮作用。
【附圖說明】
[0022]圖1為DADS對輻照小鼠睪丸組織形態學的影響;HE染色，放大倍數:200倍；圖中，A 為對照組(溶劑+〇Gy)、B為藥物組(40mg/kg DADS+OGy)、C為照射組(溶劑+4Gy)、D為低濃度 藥物+照射組（l〇mg/kg DADS+4Gy)、E為中濃度藥物+照射組（20mg/kg DADS+4Gy)、F為高濃 度藥物+照射組(40mg/kg DADS+4Gy)。
【具體實施方式】
[0023]以下結合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發明，但實施例并不對本發明 做任何形式的限定。除非特別說明，本發明采用的試劑、方法和設備為本技術領域常規試 劑、方法和設備。
[0024]除非特別說明，本發明所用試劑和材料均為市購。
[0025] 實施例1 [0026] 1、材料與方法
[0027] 1.1實驗材料
[0028] DADS購自于 Sigma公司。
[0029] 丙二醛(MDA)試劑盒、總羰基試劑盒及8-羥基脫氧鳥苷(S-OHdG)試劑盒購自于碧 云天生物技術研究所。
[0030] BCA試劑盒購于Thermo公司。其余為分析純。
[0031] 1.2實驗動物
[0032]健康雄性昆明小鼠，標準體重（18~22)g，由廣東省實驗動物中心提供(許可證號： SCXK(粵）2013-0002 )。
[0033]飼養環境溫度（18~25) °C。安靜環境飼養，動物自由飲食飲水，正常晝夜節律。飼 養適應環境3d后進行實驗。
[0034] 動物實驗經學校倫理委員會批準，并嚴格按規定操作。
[0035] 1.3照射條件
[0036]腫瘤放射治療儀器Elekta-Synergy提供X射線。照射參數：能量為6MV，源皮距照 射，深度1 · 5cm，射野28 X 18cm2，劑量4Gy，時間0 · 7min。照射方式為單次全身照射。
[0037] 1.4實驗分組
[0038] (1)實驗小鼠隨機分為以下6組，每組8只小鼠：
[0039] A組為對照組(溶劑+OGy)，
[0040] B組為藥物組(40mg/kg DADS+OGy)，
[00411 C組為照射組(溶劑+4Gy)，
[0042] D組為低濃度藥物+照射組（10mg/kg DADS+4Gy)，
[0043] E組為中濃度藥物+照射組(20mg/kg DADS+4Gy)，
[0044] F組為高濃度藥物+照射組(40mg/kg DADS+4Gy)。
[0045] (2)溶解稀釋DADS的溶劑為花生油。照射前Ih腹腔注射給藥。注射量控制為0.2ml/ 只。
[0046] 對照組與照射組分別注射0.2ml/只的溶劑。
[0047] 1.5病理組織切片
[0048] 照射后12h，頸椎脫臼法處死小鼠，取出一側睪丸，剪切部分用福爾馬林固定后送 往肇慶醫學高等專科學校附屬醫院制作HE病理切片。
[0049] 1.6精子活力、精子畸形率檢測
[0050] 照射后12h，頸椎脫臼法處死小鼠，取出雙側附睪置于生理鹽水中，剪碎制成精子 懸液，35 °C孵育20min后注入35 °C預熱的血細胞計數板中，高倍鏡下觀察100個精子的活動 情況。精子的活動度分4級：I精子成直線快速游動，II精子不成直線游動而且速度較慢，III 精子原地活動，IV精子靜止。
[0051] 采用精子活力計算公式：（1+11+111)/(1+11+111+1￥)\100%[01&即（：，01611￥1'， Yeh SD，et al . Infertility with defective spermatogenesis and hypotestosteronemia in male mice lacking the androgen receptor in Sertoli cells[J].Proc.Natl.Acad.Sci·2004,101:6876-81·]〇
[0052] 取制成的精子懸液制作涂片、甲醇固定自然晾干，I %伊紅染色lh，清水沖洗、干 燥。顯微鏡下觀察1000個精子計算精子畸形率，畸形率用百分比表示。畸形精子分為頭、體 及尾形態畸形。頭畸形有雙頭、巨頭、無定型;體畸形有粗大、折裂、不完整;尾畸形有雙尾、 卷尾、缺尾。
[0053] 1.7蛋白質總羰基含量、MDA及8-OHdG檢測
[0054] 取小鼠剩余的全部睪丸用生理鹽水制成10 %的組織勻漿，4°C下3500r/min離心 lOmin，取上清液分裝冷凍儲存備用。取備用上清液測定蛋白質總羰基含量(蛋白質氧化損 傷指標）、MDA(脂質氧化損傷指標)及S-OHdG(核酸氧化損傷指標)等損傷指標。實驗操作方 法嚴格按照試劑盒說明進行。蛋組織白質濃度用BCA試劑盒測定。
[0055] 1.8數據統計分析
[0056] SPSS17.0進行數據統計分析。所有數值表示為平均數土標準差(means 土 SD )，各組 數據采用均值單因素檢驗。取P〈〇.05代表顯著的統計學差異。
[0057] 2、實驗結果
[0058] 2.1 DADS對輻照小鼠睪丸組織形態學的影響如附圖1所示，HE染色，放大倍數:200 倍。圖1中，A為對照組(溶劑+OGy)、B為藥物組(40mg/kg DADS+OGy)、C為照射組(溶劑+4Gy)、 D為低濃度藥物+照射組（10mg/kg DADS+4Gy)、E為中濃度藥物+照射組（20mg/kg DADS+ 4Gy)、F為高濃度藥物+照射組(40mg/kg DADS+4Gy)。
[0059] 睪丸組織生精小管由精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞、精子細胞及精子等 5至6層細胞構成。
[0060] 如圖1所示，與A組相比，C組生精小管細胞層次嚴重受損，表明X射線造成了生精小 管上皮細胞的大量丟失。與C組比，D組生精小管在形態學上細胞層次出現了增多，表明DADS 能降低X射線對小鼠生精小管上皮細胞的丟失。E組與F組生精小管上皮細胞層次增多更為 顯著。與A組相比，B組無形態學改變，說明40mg/kg DADS沒有造成小鼠生精小管上皮細胞丟 失。
[0061 ] 2.2 DADS對輻照小鼠精子活力的影響
[0062]如表1所示，與A組相比，C組精子活力顯著下降(p〈0.05)，顯示X射線嚴重損傷了精 子的活力。D組與C組比，精子活力顯著上升(ρ〈0·05)，表明DADS能降低X射線對小鼠精子活 力的影響，并且隨著藥物濃度增加輻射防護效果更好。E組與F組相比，精子活力無顯著性差 異(ρ>0.05)。與A組相比，B組精子活力并沒有下降，說明40mg/kg DADS沒有造成小鼠精子活 力下降。
[0063] 表1 DADS對福照小鼠精子活力的影響(n = 8,means土SD)
[0065] ap〈0.05vs A組；bp〈0.05vs C組
[0066] 2.3 DADS對輻照小鼠精子畸形率的影響
[0067]如表2所示，C組與A組比，精子畸形率顯著性增加 (p〈0.05)，表明X射線導致大量精 子畸形。與C組相比，D組精子畸形率顯著性下降(p〈0.05)，說明DADS能有效對抗X射線對精 子的損傷反應。E組與F組相比精子畸形率無差異性(p>0.05)』組與A組之間精子畸形率無 顯著性差異(P>〇.〇5)，表明40mg/kg DADS未造成小鼠精子畸形率上升。
[0068] 表2 DADS對輻照小鼠精子畸形率的影響(n = 8，means土SD)
[0070] ap〈0.05vs A組；bp〈0.05vs C組
[0071] 2.4 DADS對輻照小鼠睪丸組織中蛋白質羰基含量的影響
[0072]如表3所示，C組與A組比，蛋白質羰基含量顯著性增加 (p〈0.05)，說明X射線損傷了 睪丸組織細胞中的蛋白質。與C組相比，D組蛋白質羰基含量顯著性下降(p〈0.05)，表明DADS 能保護部分蛋白質免受X射線的損傷。E組與F組相比蛋白質羰基含量無差異性(p>0.05)』 組與A組之間蛋白質羰基含量無顯著性差異(p>0.05)，表明40mg/kg DADS未造成小鼠睪丸 組織蛋白質羰基含量上升。
[0073] 表3 DADS對輻照小鼠睪丸組織蛋白質羰基含量的影響(n = 8，means土SD)
[0075] ap〈0.05vs A組；bp〈0.05vs C組
[0076] 2.5 DADS對輻照小鼠睪丸組織中MDA含量的影響
[0077] 如表4所示，C組與A組比，MDA含量顯著性增加 (p〈0.05)，表明X射線對大量脂質造 成了損傷。與C組相比，D組MDA含量顯著性下降(p〈0.05)，說明DADS有效的對抗了 X射線對脂 質的損傷反應;E組與F組相比MDA含量無差異性(p>0.05) 3組與A組之間MDA含量無顯著性 差異(p>0.05)，提示40mg/kg DADS未造成小鼠睪丸組織MDA含量上升。
[0078] 表4 DADS對輻照小鼠睪丸組織MDA的影響（n = 8，means土SD)
[0080] ap〈0.05vs A組；bp〈0.05vs C組
[0081] 2.6 DADS對輻照小鼠睪丸組織中8-OHdG含量的影響
[0082] 如表5所示，C組與A組比，8-OHdG含量顯著性增加(p〈0.05)，提示X射線對核酸造成 了損傷反應。與C組相比，D組S-OHdG含量顯著性下降(p〈0.05)，說明DADS能有效降低X射線 對核酸的損傷反應。E組與F組相比8-OHdG含量無差異性(p>0.05)。B組與A組之間8-OHdG含 量無顯著性差異(P>〇.〇5)，表明40mg/kg DADS未造成小鼠睪丸組織8-OHdG含量上升。
[0083] 表5 DADS對輻照小鼠睪丸組織8-OHdG的影響(n = 8，means土SD)
[0085] ap〈0.05vs A組；bp〈0.05vs C組。
【主權項】
1. 二烯丙基二硫在制備預防和/或治療輻射對睪丸組織的損傷的藥物中的應用。2. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述應用是指二烯丙基二硫在制備能夠降 低輻射對精子活力的影響的藥物中的應用。3. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述應用是指二烯丙基二硫在制備能夠對 抗輻射對精子的致畸作用的藥物中的應用。4. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述應用是指二烯丙基二硫在制備能夠保 護睪丸組織細胞中的蛋白質免受輻射的損傷的藥物中的應用。5. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述應用是指二烯丙基二硫在制備能夠有 效對抗輻射對睪丸組織細胞脂質的損傷的藥物中的應用。6. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述應用是指二烯丙基二硫在制備能夠有 效對抗輻射對睪丸組織細胞核酸的損傷的藥物中的應用。7. 根據權利要求1~6任一所述的應用，其特征在于，所述輻射是指X射線輻射。8. 根據權利要求1、4~6任一所述的應用，其特征在于，所述睪丸組織具體是指睪丸組 織中的生精細胞和/或精子。9. 一種能夠預防和/或治療輻射對睪丸組織的損傷的藥物，其特征在于，所述藥物包含 有一稀丙基一硫D
【文檔編號】A61P39/00GK106074467SQ201610614453
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月28日 公開號201610614453.2, CN 106074467 A, CN 106074467A, CN 201610614453, CN-A-106074467, CN106074467 A, CN106074467A, CN201610614453, CN201610614453.2
【發明人】許帥, 鄒錦慧, 廖偉雄, 李捷
【申請人】肇慶醫學高等專科學校