本發明涉及微生物技(ji)術領域，具體的說是一種拮抗內生細菌gh011及應用。

背景技術：

番(fan)茄灰霉病已成為(wei)我國(guo)保護地番(fan)茄生(sheng)(sheng)產的(de)主要(yao)病害，灰霉病是由半知菌(jun)(jun)亞門真菌(jun)(jun)灰葡萄孢(botrytiscinerea)侵染(ran)所致。目前番(fan)茄抗(kang)病育(yu)種還沒有突破性進展，國(guo)內防(fang)(fang)治(zhi)(zhi)番(fan)茄灰霉病主要(yao)依(yi)靠化(hua)學(xue)藥(yao)劑(ji)。然而，長期、連續(xu)用藥(yao)使灰霉病菌(jun)(jun)產生(sheng)(sheng)了抗(kang)藥(yao)性，導致化(hua)學(xue)藥(yao)劑(ji)防(fang)(fang)治(zhi)(zhi)效果逐年下降，并(bing)且化(hua)學(xue)藥(yao)劑(ji)殘留嚴重污染(ran)農產品和環境，危及人畜(chu)健康。生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)防(fang)(fang)治(zhi)(zhi)已經成為(wei)控制病害的(de)重要(yao)手段(duan)，而植物(wu)(wu)內生(sheng)(sheng)細菌(jun)(jun)作為(wei)植物(wu)(wu)病害生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)防(fang)(fang)治(zhi)(zhi)的(de)潛在(zai)資源菌(jun)(jun)具有獨特的(de)優(you)勢，并(bing)且已經顯示出很好的(de)利用前景(jing)。

技術實現要素：

本發明目的是提供一株可應用于治療和預防番茄灰霉病的拮抗內生細菌gh011，分類命名為bacillusaxarquiensis，已保(bao)藏(zang)于中國典型(xing)培養(yang)物保(bao)藏(zang)中心，保(bao)藏(zang)單位簡稱(cheng)為cctcc，保(bao)藏(zang)編號cctccno：m2017096。

本發明的另一目的是(shi)提供(gong)一種治療和預防番茄灰霉病的制劑。

所述拮抗內生細菌gh011可用于抑制桂花葉斑病菌（葡萄座腔菌，b.dothidea）和番茄灰霉病菌（b.cinerea）。

所述(shu)治療和預(yu)防番茄灰(hui)霉病的制劑為拮抗(kang)內生(sheng)細(xi)菌gh011培養液。

所述拮抗內生細菌gh011培養液中含有菌落4×108cfu·ml^–1。

所述拮抗內生細菌gh011培養液的制備方法為：接種拮抗內生細菌gh011單菌落于lb液體培養基中，28℃的恒溫振蕩培養箱中160r·min^-1培養24h，采用無菌水將培養后所得菌液的菌落稀釋至4×10⁸cfu·ml^–1。

所(suo)述制劑治療和預防(fang)番茄灰霉(mei)病(bing)的方法：采用拮(jie)抗內生(sheng)細菌gh011培(pei)養液對番茄植株進行噴(pen)霧(wu)，進一步(bu)說是將拮(jie)抗內生(sheng)細菌gh011培(pei)養液噴(pen)在番茄葉片的正反面。

有益效果

本發明的(de)拮(jie)抗內(nei)(nei)生(sheng)(sheng)細菌(jun)(jun)(jun)(jun)gh011在與宿主植(zhi)物(wu)(wu)協同進(jin)化的(de)過(guo)程(cheng)中，形成(cheng)了穩(wen)定(ding)的(de)生(sheng)(sheng)態關系，內(nei)(nei)生(sheng)(sheng)細菌(jun)(jun)(jun)(jun)可以通(tong)過(guo)自身產生(sheng)(sheng)或(huo)誘導(dao)宿主產生(sheng)(sheng)一(yi)些抗菌(jun)(jun)(jun)(jun)的(de)物(wu)(wu)質(zhi)，或(huo)通(tong)過(guo)與植(zhi)物(wu)(wu)病(bing)(bing)原(yuan)菌(jun)(jun)(jun)(jun)競(jing)爭(zheng)生(sheng)(sheng)態位和營(ying)養物(wu)(wu)質(zhi)對(dui)植(zhi)物(wu)(wu)病(bing)(bing)害起到防(fang)(fang)治作(zuo)用(yong)。該(gai)抗內(nei)(nei)生(sheng)(sheng)細菌(jun)(jun)(jun)(jun)gh011能有(you)效預(yu)防(fang)(fang)和治療番(fan)茄灰霉(mei)病(bing)(bing)，防(fang)(fang)治效果達到64.9%，且該(gai)菌(jun)(jun)(jun)(jun)對(dui)桂花(hua)葉(xie)斑(ban)病(bing)(bing)菌(jun)(jun)(jun)(jun)（葡萄座腔菌(jun)(jun)(jun)(jun)）抑菌(jun)(jun)(jun)(jun)率(lv)達83.69%。此外，該(gai)拮(jie)抗內(nei)(nei)生(sheng)(sheng)細菌(jun)(jun)(jun)(jun)gh011對(dui)桂花(hua)炭疽病(bing)(bing)菌(jun)(jun)(jun)(jun)、桂花(hua)葉(xie)斑(ban)病(bing)(bing)菌(jun)(jun)(jun)(jun)（刺(ci)球殼菌(jun)(jun)(jun)(jun)）和番(fan)茄葉(xie)霉(mei)病(bing)(bing)菌(jun)(jun)(jun)(jun)三種病(bing)(bing)原(yuan)菌(jun)(jun)(jun)(jun)也有(you)一(yi)定(ding)程(cheng)度的(de)拮(jie)抗作(zuo)用(yong)，具有(you)較好的(de)應用(yong)前景。

生物材料的保藏

一株拮抗內生細菌gh011，分類命名為bacillusaxarquiensisgh011，已(yi)保(bao)藏(zang)于中國典(dian)型(xing)培養物保(bao)藏(zang)中心，保(bao)藏(zang)單位簡稱(cheng)為(wei)(wei)cctcc，保(bao)藏(zang)地址為(wei)(wei)中國武(wu)漢(han)武(wu)漢(han)大學(xue)，保(bao)藏(zang)編號為(wei)(wei)cctccno：m2017096，保(bao)藏(zang)日(ri)期(qi)為(wei)(wei)2017年3月8日(ri)。

附圖說明

圖(tu)1是本發明(ming)拮抗內生(sheng)細菌gh011對桂花葉(xie)斑病(bing)菌的抑菌效果圖(tu)；

圖2是本發明拮(jie)抗內生細菌gh011對番茄灰(hui)霉病菌抑菌效果的圖；

圖(tu)中：左為對照，右為抑菌效果。

具體實施方式

實施例1

采用預防番茄灰霉病的制(zhi)劑進行盆栽(zai)番茄防治：

步驟一、接種gh011菌株單菌落于200mllb液體培養基中，28℃的恒溫振蕩培養箱中160r·min^-1培養24h，將所培養的菌液稀釋至4×10⁸cfu·ml^–1，制備(bei)出預防(fang)番茄灰霉病的(de)制劑(ji)；

步驟二、取長至5-6葉，長勢一致的盆栽番茄，用治療和預防番茄灰霉病制劑噴霧至番茄葉片正反面，以清水作為對照，24h后將番茄灰霉病菌的孢子懸浮液1×10⁷個(ge)孢(bao)子/ml（將少許無(wu)菌(jun)水注入已長滿(man)灰霉病菌(jun)的(de)(de)pda平板內，將瓊脂表面(mian)的(de)(de)孢(bao)子刮(gua)下，倒入無(wu)菌(jun)容器內，充(chong)分(fen)(fen)振蕩后用(yong)滅菌(jun)的(de)(de)紗(sha)布過濾，于血球(qiu)計(ji)數板中計(ji)數）噴霧接(jie)種其上。番茄植(zhi)株(zhu)(zhu)培養(yang)于人(ren)工氣候箱（23℃，r≧90%）中。每個(ge)處(chu)理3盆，每盆3株(zhu)(zhu)，重復3次。接(jie)種后7d調查番茄的(de)(de)發(fa)病情況，病情分(fen)(fen)級(ji)(ji)采取(qu)5級(ji)(ji)標準。0級(ji)(ji)：無(wu)病斑(ban)，葉片(pian)無(wu)癥狀，植(zhi)株(zhu)(zhu)健康；1級(ji)(ji)：病斑(ban)面(mian)積占總葉片(pian)的(de)(de)10%以下；2級(ji)(ji)：病斑(ban)面(mian)積占總葉片(pian)的(de)(de)10%-50%；3級(ji)(ji)：病斑(ban)面(mian)積占總葉片(pian)的(de)(de)50%以上；4級(ji)(ji)：植(zhi)株(zhu)(zhu)死(si)亡。

病(bing)(bing)情(qing)(qing)指(zhi)數(shu)=100×[σ（各(ge)級病(bing)(bing)葉數(shu)×病(bing)(bing)害級別數(shu)）]/（調查總(zong)葉數(shu)×4）防(fang)治效果(guo)（%）=[（對照病(bing)(bing)情(qing)(qing)指(zhi)數(shu)-拮抗(kang)菌株處理后病(bing)(bing)情(qing)(qing)指(zhi)數(shu)）]/對照病(bing)(bing)情(qing)(qing)指(zhi)數(shu)]×100

結果(guo)表(biao)明：噴(pen)霧治(zhi)療(liao)和預(yu)防番茄灰霉病(bing)制劑的(de)番茄植(zhi)株(zhu)比用(yong)清水處理的(de)病(bing)情指數降低23.1，防治(zhi)效果(guo)為64.9%（見表(biao)1）。

表(biao)1菌株gh011對番(fan)茄(qie)灰霉病的防治效果

實施例2

拮抗內生細(xi)菌(jun)gh011菌(jun)株的篩選、分(fen)離和純化:

步驟一、培養基的制備：

細(xi)菌(jun)平板培(pei)(pei)(pei)養(yang)用(yong)lb培(pei)(pei)(pei)養(yang)基（胰蛋白胨(dong)10g/l；酵母(mu)提(ti)取物5g/l；氯化鈉10g/l；瓊脂(zhi)(zhi)粉18g/l），液(ye)體(ti)培(pei)(pei)(pei)養(yang)用(yong)lb液(ye)體(ti)培(pei)(pei)(pei)養(yang)基（不(bu)加瓊脂(zhi)(zhi)粉），真菌(jun)培(pei)(pei)(pei)養(yang)及平板對峙試驗用(yong)pda培(pei)(pei)(pei)養(yang)基（馬鈴薯(shu)200g/l；葡萄糖20g/l；瓊脂(zhi)(zhi)粉18g/l）。

步驟(zou)二、采(cai)集健康桂花植株(zhu)的(de)葉片(pian)3g，在75%的(de)酒精中(zhong)(zhong)浸(jin)泡30s，然后用(yong)1%的(de)次(ci)(ci)氯酸鈉消(xiao)毒3min，用(yong)無菌(jun)(jun)蒸(zheng)餾水沖(chong)(chong)洗(xi)5次(ci)(ci)后，取最后一次(ci)(ci)的(de)沖(chong)(chong)洗(xi)液(ye)(ye)200μl，涂(tu)布(bu)于lb培(pei)養(yang)基平板上；消(xiao)毒后的(de)葉片(pian)于無菌(jun)(jun)的(de)研(yan)(yan)缽中(zhong)(zhong)研(yan)(yan)磨，加入5ml無菌(jun)(jun)蒸(zheng)餾水混勻，取研(yan)(yan)磨液(ye)(ye)200μl，涂(tu)布(bu)于lb培(pei)養(yang)基平板上。在28℃培(pei)養(yang)，逐日觀察，如最后一次(ci)(ci)沖(chong)(chong)洗(xi)液(ye)(ye)涂(tu)布(bu)的(de)培(pei)養(yang)基中(zhong)(zhong)無菌(jun)(jun)落，研(yan)(yan)磨液(ye)(ye)涂(tu)布(bu)的(de)培(pei)養(yang)基中(zhong)(zhong)長(chang)出的(de)菌(jun)(jun)落是內(nei)生菌(jun)(jun)，進行(xing)純化培(pei)養(yang)后，4℃冰箱中(zhong)(zhong)保(bao)存備用(yong)。

步驟三、拮抗(kang)活性測定

番茄灰霉病菌、番茄葉霉病菌、桂花葉斑病菌(刺球殼)、桂花炭疽病菌和桂花葉斑病菌（葡萄座腔菌）活化(hua)培養，制(zhi)成8mm的菌(jun)(jun)餅(bing)放置于pda培養基中心，四周40mm處分別放置四片8mm大小含(han)有內(nei)生細菌(jun)(jun)的濾(lv)紙片，置于28℃培養箱(xiang)內(nei)培養4~5天，測量抑菌(jun)(jun)圈半徑并(bing)計算抑菌(jun)(jun)率(lv)。

從健康桂花的葉片中共分離出24株內生細菌(jun)，其中分離得到(dao)的gh011抑菌(jun)活性最強，對桂花葉斑(ban)病(bing)(bing)菌(jun)（葡(pu)萄(tao)座(zuo)腔菌(jun)）抑菌(jun)率達(da)83.69%，如(ru)圖(tu)1所示(shi)(shi)；對番茄灰霉病(bing)(bing)菌(jun)抑菌(jun)率達(da)74.83%，如(ru)圖(tu)2所示(shi)(shi)；對其他(ta)三種(zhong)病(bing)(bing)原菌(jun)也(ye)有一定程(cheng)度(du)的拮抗作(zuo)用，結果如(ru)表2所示(shi)(shi)。

表2：菌(jun)株(zhu)gh011發酵液(ye)對5種病原真菌(jun)的抑菌(jun)率

步驟四、強(qiang)拮抗(kang)內生菌株(zhu)的(de)鑒定

1、形態及生理生化鑒定(ding)

方法(fa)參考《伯杰氏細菌鑒定手冊》(buchanan＆gibbons，1984)和(he)《常見細菌系統(tong)鑒定手冊》(東(dong)秀珠和(he)蔡妙英，1999)。

1）形態特征

菌株gh011細胞為桿狀、單生(sheng)或鏈生(sheng)、周生(sheng)鞭毛，革蘭氏染色陽(yang)性。菌落呈(cheng)淡(dan)黃色、不透明，邊緣不規則。

2）生理生化特征

菌(jun)株gh011為好氧菌(jun)，不(bu)能(neng)運動，可以(yi)利用蔗糖(tang)、果(guo)糖(tang)、葡萄糖(tang)、麥芽(ya)糖(tang)、甘露醇(chun)，但不(bu)能(neng)利用乳糖(tang)，可以(yi)水解淀粉(fen)和(he)明膠，可分解牛奶產(chan)酸，檸檬酸鹽試(shi)驗(yan)(yan)、v-p試(shi)驗(yan)(yan)、硝酸鹽還原試(shi)驗(yan)(yan)和(he)接觸酶(mei)試(shi)驗(yan)(yan)呈(cheng)陽性，苯丙氨酸脫氫酶(mei)實(shi)驗(yan)(yan)、甲基紅試(shi)驗(yan)(yan)和(he)氧化酶(mei)試(shi)驗(yan)(yan)呈(cheng)陰性，最(zui)適生(sheng)長ph7.0，最(zui)適生(sheng)長溫度30℃。

2、16srdnapcr擴增(zeng)、測序(xu)及(ji)系統發育分析

以細菌(jun)基因組dna快速(su)抽(chou)提試劑(ji)盒（上海生(sheng)工生(sheng)物(wu)工程公司(si)refb518225-0050）提取的菌(jun)株gh011基因組dna為模板。16srdnapcr擴增(zeng)采用(yong)引物(wu)：16sl：5'-acggctaccttgttacgacct-3'（其序列(lie)如seqidno:3）

和引物16sr:5'-agagtttgatcctggctcag-3'（其序列如seqidno:4）gyra基因pcr擴增采用引物gyra-f:cgatcaggaaatgcgtacgtcctt（其序列如seqidno:5）和引物gyra-r:caaggtaatgctccaggcattgct（其序列如seqidno:6）。反應體系(50μl)：10×buffer5.0μl、dntps(2.5mmol·l^-1)4.0μl、引物16sr(10pmol·l^-1)2.0μl、引物16sl(10pmol·l^-1)2.0μl、taq酶(5u·μl^-1)0.5μl、模板dna(50ng·μl^-1)2μl、ddh2o34.5μl。pcr反(fan)應(ying)程序(xu)(xu)(xu)(xu):94℃5min，94℃1min，50℃1min，72℃2min，30個循(xun)環；72℃10min。將pcr產物經純化后(hou)送上海生(sheng)工(gong)生(sheng)物工(gong)程公司測(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)。根據測(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)結果，用blast軟件(jian)從genbank數據庫(ku)中調出相(xiang)關(guan)菌(jun)株的(de)16srdna序(xu)(xu)(xu)(xu)列和gyra基(ji)因(yin)序(xu)(xu)(xu)(xu)列，分(fen)別用clustalwv1.82軟件(jian)進(jin)行多序(xu)(xu)(xu)(xu)列比(bi)對，之后(hou)用mega4.1軟件(jian)進(jin)行序(xu)(xu)(xu)(xu)列分(fen)析，采用鄰接(jie)法(fa)(neighbor-joining，nj法(fa))進(jin)行系(xi)統發育分(fen)析和同源性比(bi)較(jiao)。

結果顯示：菌株gh011的16srdna（基因序列如seqidno：1所示）和gyra基因序列（如seqidno：2所示）與bacillusaxarquiensis同源性均高達99%。結合其形態特征、生理生化特性、16srdna（基因序列如seqidno：1所示），和gyra基因序列分析，將該菌株鑒定為b.axarquiensisgh011。

sequencelisting

<110>河南科技大學(xue)

<120>一株拮抗內生細菌(jun)gh011及(ji)應用

<130>1

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1515

<212>dna

<213>bacillusaxarquiensis

<400>1

tacggctaccttgttacgacctcaccccaatcatctgtcccaccttcggcggctggctcc60

ataaaggttacctcaccgacttcaggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtg120

tacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccag180

cttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaacagatttgtgggattggct240

taacctcgcggtttcgctgccctttgttctgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtc300

ataaggggcatgatggtttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtca360

ccttagagtgcccaactgaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggac420

ttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgccc480

ccgaaggggacgtcctatctctaggattgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttctt540

cgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctt600

tgagtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagca660

ctaaggggcggaaaccccctaacacttagcactcatcgtttacggtgtggactaccaggg720

tatctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagttacagaccagagag780

tcgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaatt840

ccactctcctcttctgcactcaagttccccagtttccaatgaccctccccggttgagccg900

ggggctttcacatcagacttaaggaaccgcctgcgagccctttacgcccaataattccgg960

acaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttct1020

ggttaggtaccgtcaaggtaccgccctattcgaacggtacttgttcttccctaacaacag1080

agctttacgatccgaaaaccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtcc1140

attgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccag1200

tgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgttgccttggtgagccattacctca1260

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atttaccttgaa1032

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<213>人工序列

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<211>24

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