芪類化合物在抑制紫色色桿菌群體感應系統中的應用
【專利摘要】本發明公開了芪類化合物在抑制紫色色桿菌群體感應系統中的應用，包括三種芪類化合物，即白藜蘆醇、白皮杉醇和氧化白藜蘆醇。在紫色色桿菌中，紫色色素的產生是由群體感應控制的。白藜蘆醇、白皮杉醇和氧化白藜蘆醇三種芪類化合物在亞致死濃度下，即在不影響紫色色桿菌生長的情況下，均能顯著抑制其群體感應，其中白藜蘆醇的活性最高。白藜蘆醇、白皮杉醇和氧化白藜蘆醇三種芪類化合物能夠制備成紫色色桿菌群體感應抑制劑，有效抑制群體感應，預防菌體感染，在臨床抑菌應用中具有重要的實際價值。
【專利說明】
芪類化合物在抑制紫色色桿菌群體感應系統中的應用
技術領域
[0001]本發明屬于醫藥技術領域，涉及芪類化合物在抑制紫色色桿菌群體感應系統中的應用，具體涉及白藜蘆醇、白皮杉醇和氧化白藜蘆醇三種芪類化合物在抑制紫色色桿菌群體感應系統中的應用。
【背景技術】
[0002]細菌可以產生、釋放并檢測一種稱為自體誘導物(autoinducerhAI)的化學信號分子，這種信號分子的濃度隨著菌群密度的增加而增加，根據信號分子濃度的變化，細菌可以探知到周圍菌群濃度的變化情況。當信號分子濃度達到一定閾值時，細菌能夠溝通協調群體行為，調控基因的表達。細菌的這種化學交流機制被稱為群體感應(Quorum Sensing，QS)。細菌的群體感應系統調控著細菌的一些重要生理功能，包括致病菌毒力因子的產生及生物被膜的形成。因此，尋找合適的群體感應抑制劑(Quorum sensing inhibitors，QSIs)，在不殺死致病菌的前提下降低其致病性，進而減少抗生素的使用量，避免耐藥菌株的形成，成為治療細菌感染的新策略。
[0003]最早發現的具有QS抑制活性的天然產物是從紅藻中分離得到的溴化呋喃酮，它能夠抑制銅綠假單胞菌等細菌的QS活性，大幅降低細菌生物膜對抗生素的抗性(Gram，L.，etal.Applied and environmental microb1logy，1996.62( 11): 4284-4287)。從葡萄和花生等食物中分離出的一種天然抗毒素白藜蘆醇，已被證明具有抗炎、抗氧化等多種活性，并能抑制奇異變形桿菌毒力因子的表達(Won-Bo Wang , et al.Journal of MedicalMicrob1logy(2006),55,1313-1321)ο
[0004]芪類化合物是一種抗菌的植物抗毒素，廣泛存在于植物界中，目前，芪類化合物的研究集中在其抗菌、抗氧化及抗癌等生物活性方面，但其對紫色色桿菌是否具有QSI活性仍未有報道。因此我們選用芪類化合物作為研究對象來篩選群體感應抑制劑。
【發明內容】
[0005]本發明的目的之一是提供芪類化合物在抑制紫色色桿菌群體感應系統中的應用，具體是白藜蘆醇、白皮杉醇和氧化白藜蘆醇三種芪類化合物在抑制紫色色桿菌群體感應中的應用。
[0006]本發明的目的之二是提供芪類化合物在制備紫色色桿菌群體感應抑制劑中的應用。
[0007]本發明的目的之三是提供芪類化合物在紫色色桿菌群體感應抑制劑中的最低有效濃度，其中，白藜蘆醇的最低有效濃度為25μΜ，優選為ΙΟΟμΜ以上；白皮杉醇的最低有效濃度為50μΜ，優選為150μΜ以上;氧化白藜蘆醇的最低有效濃度為25μΜ，優選為150μΜ以上。
[0008]本發明具有以下有益效果:
[0009]三種芪類化合物均能在不影響紫色色桿菌CV026生長的情況下，顯著抑制其群體感應，其中白藜蘆醇的活性最高。白藜蘆醇濃度在ΙΟΟμΜ以上時，其抑制率超過80 % ;白皮杉醇濃度為ΙΟΟμΜ和150μΜ時，可以顯著地抑制紫色色素的合成，抑制率分別為46%和73%;相比于其他兩種芪類化合物，氧化白藜蘆醇展現出中等的QSI活性，濃度在150μΜ時，可以顯著地抑制紫色色素的產生，抑制率高達86%。
【附圖說明】
[0010]圖1是實施例1中三種芪類化合物對紫色色桿菌群體感應抑制活性實驗結果圖，其中，a為白藜蘆醇，b為白皮杉醇，c為氧化白藜蘆醇。
[0011]圖2是白藜蘆醇對紫色色桿菌的生長及紫色色素產生的抑制結果圖。
[0012]圖3是白皮杉醇對紫色色桿菌的生長及紫色色素產生的抑制結果圖。
[0013]圖4是氧化白藜蘆醇對紫色色桿菌的生長及紫色色素產生的抑制結果圖。
【具體實施方式】
[0014]下面通過實施例和附圖對本發明作進一步的說明，其目的是幫助本領域技術人員更好地理解本發明的內容，但所舉的實施例并不限制本發明的保護范圍。
[0015]實施例1
[0016]三種芪類化合物的群體感應抑制活性判斷實驗。
[0017]配制LB液體培養基分裝到試管中，配制LB固體培養基，將LB液體培養基、固體培養基、槍頭、培養皿、離心管、紙片等滅菌烘干待用。挑取已劃線培養好的CV026單菌落，接種到LB液體培養基中，置于30°C恒溫搖床培養過夜。使用LB液體培養基做空白參比，用已滅菌的LB液體培養基將過夜菌液的OD62q調為0.1左右。將10mL融化的LB固體培養基均勻倒入6個平板中作為下層瓊脂板。待下層瓊脂板凝固后，取OD62q = 0.1的CV026菌液加入到10mL冷卻未凝固的LB固體培養基(50 °C左右)中，同時加入信號分子C6-HSL和卡那霉素，劇烈混合后均勻地倒在上述下層瓊脂板的表面，作為上層瓊脂板。待平板冷凝后，用已滅菌的打孔器打孔，在孔中加入25yL不同濃度的待測化合物，溶劑DMSO和慶大霉素作為陰性對照，30°C倒置培養24小時后觀察實驗現象。
[0018]圖1是三種芪類化合物對紫色色桿菌群體感應抑制活性實驗結果圖，其中，a為白藜蘆醇，b為白皮杉醇，c為氧化白藜蘆醇，1、2、3、4四個孔加藥濃度分別為lmg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL，D為DMSO，G為慶大霉素。如圖1所示，白藜蘆醇、白皮杉醇和氧化白藜蘆醇抑制了CV026紫色色素的產生，在孔的周圍形成了白色暈圈，且白色暈圈的直徑隨藥物濃度的增加而增大，呈現出劑量依賴效應。其中，白藜蘆醇周圍靠近孔的地方出現了與對照組慶大霉素周圍類似的透明抑菌圈，展現出抑菌活性;隨著藥物在瓊脂板上擴散，藥物的濃度也隨之降低，在透明抑菌圈的外圍又出現了不透明的、渾濁的白色暈圈，展現出群體感應抑制活性。此外，在相同的工作濃度下，白藜蘆醇周圍白色暈圈的直徑要明顯大于白皮杉醇和氧化白藜蘆醇，這表明白藜蘆醇具有較強的群體感應抑制活性。
[0019]實施例2
[0020]三種芪類化合物抑制紫色色桿菌CV026生長及紫色色素產生實驗。
[0021]配制LB液體培養基分裝到錐形瓶中，滅菌后待用。挑取已劃線培養好的CV026單菌落，接種到LB液體培養基中，置于30°C恒溫搖床培養過夜。在已滅菌的LB液體培養基中加入C6-HSL(信號分子)、過夜菌液和各濃度的待測化合物(終濃度25、50、75、100、125和150μΜ)，以DMSO作為空白對照。培養16-18h后，每瓶吸取ImLX 6至6個1.5mL離心管中。離心棄上清，用DMSO將沉淀重懸，充分懸起后離心，吸取上清200yL至96孔板中測量OD585，以DMSO作為空白對照。根據OD585判斷三種芪類化合物對CV026紫色色素產生的影響。
[0022]棄掉全部上清液，用水再將沉淀重懸，充分懸起后吸取200yL至96孔板中測量OD620，以水作為空白對照。根據OD62q判斷三種芪類化合物對CV026生長的影響。
[0023]圖2、圖3、圖4分別是實施例2中白藜蘆醇、白皮杉醇和氧化白藜蘆醇三種芪類化合物對紫色色桿菌的生長及紫色色素產生的抑制結果圖。
[0024]抑菌實驗表明，與對照組相比，在所有測定濃度下，白皮杉醇和氧化白藜蘆醇均不影響CV026菌體的生長，僅白藜蘆醇在高濃度下稍微抑制了 CV026菌體的生長。
[0025]為進一步研究白藜蘆醇、白皮杉醇和氧化白藜蘆醇的QSI活性，我們用紫色色素定量檢測三種芪類化合物對CV026群體感應抑制活性。如圖2、3、4所示，與初篩實驗結果相似，經過24h的培養，白藜蘆醇、白皮杉醇和氧化白藜蘆醇均能抑制CV026紫色色素的產生，且紫色色素的產量隨藥物濃度的增加而減少，呈現出逆反關系。其中，在所有測定濃度下，白藜蘆醇均可顯著地減少紫色色素的產生，尤其當測定濃度在ΙΟΟμΜ以上時，其抑制率超過80%。對于白皮杉醇來說，其初始抑制濃度為50μΜ，在高濃度下(ΙΟΟμΜ和150μΜ)，白皮杉醇可以顯著地抑制紫色色素的合成，抑制率分別為46%和73%。相比于其他兩種芪類化合物，氧化白藜蘆醇展現出中等的QSI活性，可以在所有測定濃度下顯著地減少紫色色素的產量，當測定濃度在150μΜ時，氧化白藜蘆醇可以顯著地抑制紫色色素的產生，抑制率高達86%。
【主權項】
1.芪類化合物在抑制紫色色桿菌群體感應系統中的應用，其特征在于，所述的芪類化合物為白藜蘆醇、白皮杉醇或氧化白藜蘆醇。2.芪類化合物在制備紫色色桿菌群體感應抑制劑中的應用，其特征在于，所述的芪類化合物為白藜蘆醇、白皮杉醇或氧化白藜蘆醇。3.根據權利要求2所述的芪類化合物在制備紫色色桿菌群體感應抑制劑中的應用，其特征在于，白藜蘆醇的最低有效濃度為25μΜ;白皮杉醇的最低有效濃度為50μΜ;氧化白藜蘆醇的最低有效濃度為25μΜ。4.根據權利要求3所述的芪類化合物在制備紫色色桿菌群體感應抑制劑中的應用，其特征在于，抑制劑中白藜蘆醇的濃度為ΙΟΟμΜ以上;抑制劑中白皮杉醇的濃度為150μΜ以上；抑制劑中氧化白藜蘆醇的濃度為150μΜ以上。
【文檔編號】A01P1/00GK106074466SQ201610454892
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月21日
【發明人】賈愛群, 陳彤彤, 周金偉, 盛吉洋
【申請人】南京理工大學