雙溴丙脒二鹽酸鹽在制備抑制膀胱癌egfr靶點的藥物中的應用
【專利摘要】雙溴丙脒二鹽酸鹽在制備抑制膀胱癌EGFR靶點的藥物中的應用，屬于二脒系列類化合物醫藥及其用途。本發明雙溴丙脒二鹽酸鹽抑制SW780、RT112細胞生長的IC50在5～8μmol/L之間；其濃度與促進SW780，RT112細胞凋亡作用正相關，與p?EGFR、p?AKT、p?ERK磷酸化程度反相關。本發明以雙溴丙脒二鹽酸鹽作為抑制人膀胱癌EGFR酪氨酸激酶結構域的藥物，提高了藥物的利用效率，具有廣闊的市場前景。
【專利說明】
雙溴丙脒二鹽酸鹽在制備抑制膀胱癌EGFR靶點的藥物中的應用
技術領域
[0001]本發明屬于二脒系列類化合物醫藥及其用途。
【背景技術】
[0002]膀胱癌是常見，花費最高的惡性腫瘤之一。男女發病比例3.5:1，發病高峰年齡50-70歲。雖然膀胱癌發病率排在第九位，但由于其高復發率，治療時間長，成為花費最高的腫瘤之一。膀胱癌的發病機制復雜。最新的研究發現EGFR(epidermal growth factorreceptor，表皮生長因子受體)在膀胱癌中起作用:EGFR會導致膀胱細胞去分化;EGFR過表達在膀胱癌中的比例約12?53%，同非肌層浸潤性膀胱癌相比，肌層浸潤性膀胱癌EGFR過表達比例最高達53%;肌層浸潤性膀胱癌中有9%存在EGFR基因擴增。這些都會使EGFR持續性的激活，從而使其下游的蛋白包括SRC、STAT3、Ras、PI3K、AKT和ERK持續性的激活，導致形成腫瘤。近年來世界各大藥廠和研究機構針對EGFR酪氨酸激酶結構域，即針對EGFR靶點的小分子抑制劑的研究成為一個迫在眉睫的熱點。最近許多臨床試驗采用單用EGFR抑制劑或者聯合使用細胞毒性化療藥物探索治療復發或者轉移膀胱癌的新策略。通過使用孔祥復院士團隊中梁廣錫教授開發的idock軟件，找尋已經在美國、日本、歐洲上市的藥物，但尚未發現能抑制EGFR功能而具有抗腫瘤作用的藥物。
[0003]雙溴丙脒(Dibrompropamidine)是二脒系列化合物的成員之一，具有抑制細菌和殺細菌作用，機制在于抑制細菌的氧化代謝。雙溴丙脒還可以用于原蟲感染的治療，比如，棘阿米巴角膜炎。雙溴丙脒依西酸鹽滴眼劑或眼膏用于成人及兒童輕微的眼部和眼瞼感染，商品名有 Brolene (Aventis Pharma)，Go I den Eye (Typharm Ltd)和 Brulidine (ManxHealthcare)。目前尚未報道雙溴丙脒二鹽酸鹽(Dibromopropamidine Dihydrochloride)具有抗腫瘤的作用。

【發明內容】

[0004]本發明旨在針對EGFR靶點的小分子抑制劑提供一種制備抗腫瘤的新藥物，特別是以雙溴丙脒二鹽酸鹽作為抑制人膀胱癌EGFR酪氨酸激酶結構域的藥物。
[0005]本發明上述目的是通過以下方式實現的:
雙溴丙脒二鹽酸鹽在制備抑制膀胱癌EGFR勒點的藥物中的應用。
[0006]進一步地，所述的應用是:雙溴丙脒二鹽酸鹽具有抑制SW780、RT112細胞生長的作用，其IC5q在5?8ymol/L之間。
[0007]進一步地，所述的應用是:雙溴丙脒二鹽酸鹽的濃度與促進SW780，RT112細胞凋亡作用呈正相關，雙溴丙脒二鹽酸鹽濃度與p-EGFR、p-AKT、p-ERK磷酸化程度呈反相關。
[0008]進一步地，所述的應用是:雙溴丙脒二鹽酸鹽的濃度為10?30ymol/L，以細胞凋亡數量減少至OD值0.6計，促進SW780，RT112細胞凋亡作用時間為721101^。
[0009]本發明有益效果和進步是: 本發明通過idock軟件篩到雙溴丙脒二鹽酸鹽，經MTT實驗證實雙溴丙脒二鹽酸鹽具有抑制人膀胱癌細胞SW780、RT112存活率。經Annexin V-FITC/PI雙染法流式細胞儀檢測細胞凋亡證實雙溴丙脒二鹽酸鹽具有促進SW780、RT112凋亡的作用。Western blot實驗證實雙溴丙脒二鹽酸鹽具有抑制EGFR的功能，從而證實它是EGFR酪氨酸激酶結構域的抑制物。
[0010]本發明以現有上市的藥物為資源，從中發掘出以雙溴丙脒二鹽酸鹽在制備抑制膀胱癌EGFR靶點的藥物中的應用，使其獲得了在抗腫瘤領域的用途，提高了藥物的效率，節省了設計新藥的成本和時間，降低了患者的成本，具有廣闊的市場前景。
【附圖說明】
[0011]圖1為雙溴丙脒二鹽酸鹽抑制SW780細胞生長的MTT實驗示意圖，其IC5Q為8ymol/L。
[0012]圖2為雙溴丙脒二鹽酸鹽抑制RT112細胞生長的MTT實驗示意圖，其IC5q為5ymol/L。
[0013]圖3為SW780隨著雙溴丙脒二鹽酸鹽作用時間的延長和濃度的增加，SW780細胞存活率逐漸下降示意圖。
[0014]圖4為RTl12隨著雙溴丙脒二鹽酸鹽作用時間的延長和濃度的增加，RTl 12細胞存活率逐漸下降示意圖。
[0015]圖5為雙溴丙脒二鹽酸鹽促進SW780細胞凋亡的Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡流式細胞實驗72小時的直方圖。
[0016]圖6為對照組的SW780細胞凋亡的Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡流式細胞實驗72小時的示意圖。
[0017]圖7為3ymol/L濃度的雙溴丙脒二鹽酸鹽與對照組比較促進SW780細胞凋亡的Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡流式細胞實驗72小時的示意圖。
[0018]圖8為ΙΟμπιοΙ/L濃度的雙溴丙脒二鹽酸鹽與對照組比較促進SW780細胞凋亡的Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡流式細胞實驗72小時的示意圖。
[0019]圖9為30ymol/L濃度的雙溴丙脒二鹽酸鹽與對照組比較促進SW780細胞凋亡的Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡流式細胞實驗72小時的示意圖。
[0020]圖10為雙溴丙脒二鹽酸鹽促進RT112細胞凋亡的Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡流式細胞實驗72小時的直方圖。
[0021]圖11為對照組的RTl 12細胞凋亡的Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡流式細胞實驗72小時的觀測示意圖。
[0022]圖12為3ymol/L濃度的雙溴丙脒二鹽酸鹽與對照組比較促進RTl12細胞凋亡的Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡流式細胞實驗72小時的觀測示意圖。
[0023]圖13為ΙΟμπιοΙ/L濃度的雙溴丙脒二鹽酸鹽與對照組比較促進RTl12細胞凋亡的Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡流式細胞實驗72小時的觀測示意圖。
[0024]圖14為30ymol/L濃度的雙溴丙脒二鹽酸鹽與對照組比較促進RTl12細胞凋亡的Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡流式細胞實驗72小時的觀測示意圖。
[0025]圖15為雙溴丙脒二鹽酸鹽3，10，30ymol/L濃度下抑制p-EGFR磷酸化及其下游蛋白口-八1(1'、口41?1(磷酸化的￥68七61'11-13101:不意圖。
[0026]以下結合附圖對本發明【具體實施方式】做進一步說明，這些實施方式所表明的實驗結果包括但不限制本發明的保護范圍。
【具體實施方式】
[0027]l、MTT 實驗:
實驗方法:膀胱癌細胞SW780、RT112以每孔6\103個，其中，3￥780用0.125°/洲5 L-15培養基，RT112用0.125%FBS RPM1-1640培養基，在96孔板中培養24h，棄掉培養基后用含有I，3，10，3(^11101/1濃度的雙溴丙脒二鹽酸鹽的10%完全培養基，8卩3￥780用10°/^83 L-15培養基，燈112用10°/^85 RPM1-1640培養基(下同)，分別培養24，48，72h。以上培養后的SW780、1^112細胞用0.5% 3-(4,5)-二甲基噻唑-(2，5)-二苯基溴化四氮唑藍(簡稱噻唑藍)孵育4小時。生成的甲臘用200yL二甲基亞砜溶解后，于波長570nm檢測。ICso用軟件GraphPadPrism 5計算。
[0028]實驗證實:
MTT分析人膀胱癌細胞存活率如圖1'2JTT實驗證實雙溴丙脒二鹽酸鹽具有抑制SW780、RT112細胞生長的作用，其IC5q在5?8ymol/L之間。
[0029]圖3、4分別為SW780、RT112隨著雙溴丙脒二鹽酸鹽作用時間的延長和濃度的增加，SW780，RTl 12細胞存活率逐漸下降結果。
[0030]其中，雙溴丙脒二鹽酸鹽的濃度為10?30ymol/L，以細胞凋亡數量減少至0.6(0D值)計，SW780，RT112細胞凋亡作用時間為72hour。尤其是，當雙溴丙脒二鹽酸鹽的濃度為30μπιο 1/L時，提前和縮短了 SW780 ,RTll 2細胞凋亡作用時間。
[0031]2、Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡流式細胞實驗:
實驗方法:膀胱癌細胞以每孔5Χ104個/500yL，其中，SW780用0.125%FBS L-15培養基，RT112用0.125%FBS RPM1-1640培養基在24孔板中培養24h，棄掉培養基后用含有3，10，30μmol/L濃度的雙溴丙脒二鹽酸鹽的10%完全培養基進行72h的培養。72h后用去離子水將4 X結合緩沖液稀釋成I X結合緩沖液；用不含EDTA的胰酶消化細胞，于室溫100rpm離心5分鐘，收集細胞；用預冷TOS(4°C )洗細胞兩次，加入250μ1的I X結合緩沖液懸浮細胞，調節其濃度為I X1VmL;取該濃度細胞ΙΟΟμΙ懸液于5mL的流式管中，加入5μ1的Annexin V-FITC和1yL 20yg/mL的碘化丙錠溶液，混勻，避光，室溫孵育15分鐘；在流式管中加400yL PBS，流式細胞儀(Partec)分析。
[0032]實驗證實:雙溴丙脒二鹽酸鹽具有促進SW780、RT112細胞凋亡的作用，SW780、RT112隨著雙溴丙脒二鹽酸鹽濃度的增加，SW780，RT112細胞存活率下降，其72小時的顯示結果如圖5?14。
[0033]3、Western_blot 實驗實驗方法:膀胱癌細胞以每孔20-40\104個/21^，其中，31780用0.125°/^83 L-15培養基，RT112用0.125%FBS RPM1-1640培養基，二者分別在6孔板中培養24h。棄掉培養基后用含有3，10，30ymol/L濃度的雙溴丙脒二鹽酸鹽的10%完全培養基培養24h后提取細胞蛋白。收集的細胞用含有ImM蛋白磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液在4°C消化30分鐘，13,000轉離心15分鐘，收集上清，用BCA蛋白測定試劑盒(Thermo)進行蛋白濃度測定。用與上清等量的細胞裂解液通過10% SDS-PAGE分離，轉移到硝酸纖維素膜。封閉后，根據抗體使用說明書加入一抗和二抗與膜孵育。經底物顯色，使用增強化學發光檢測系統測定(Amersham, Piscataway, NJ)。使用抗β-actin抗體作為內參抗體進行校正。
[0034]實驗證實:雙溴丙脒二鹽酸鹽具有抑制p-EGFR磷酸化，因此其下游蛋白p-AKT、p-ERK磷酸化也被抑制。并且，隨著雙溴丙脒二鹽酸鹽濃度的增加，p-EGFR、p-AKT、p-ERK磷酸化程度降低(如圖15)。
【主權項】
1.雙溴丙脒二鹽酸鹽在制備抑制膀胱癌EGFR勒點的藥物中的應用。2.根據權利要求1所述的應用，其特征是:雙溴丙脒二鹽酸鹽具有抑制SW780、RT112細胞生長的作用，其IC5q在5?8ymol/L之間。3.根據權利要求1或2所述的應用，其特征是:雙溴丙脒二鹽酸鹽的濃度與促進SW780，燈112細胞凋亡作用呈正相關，雙溴丙脒二鹽酸鹽濃度與？46?1?、？^1(1'、？4孤磷酸化程度呈反相關。4.根據權利要求1或2所述的應用，其特征是:雙溴丙脒二鹽酸鹽的濃度為10?30μπιΟ1/L，以細胞凋亡數量減少至OD值0.6計，促進SW780，RT112細胞凋亡作用時間為72hour。5.根據權利要求3所述的應用，其特征是:雙溴丙脒二鹽酸鹽的濃度為10?30ymol/L，以細胞凋亡數量減少至OD值0.6計，促進SW780，RT112細胞凋亡作用時間為721101^。
【文檔編號】A61P35/00GK106074473SQ201610626162
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年8月3日 公開號201610626162.5, CN 106074473 A, CN 106074473A, CN 201610626162, CN-A-106074473, CN106074473 A, CN106074473A, CN201610626162, CN201610626162.5
【發明人】柯坤彬, 孔祥復, 李宏健, 梁廣錫, 王文漢, 林李家宓, 劉旭, 劉孝東
【申請人】昆明醫科大學, 香港中文大學, 昆明醫科大學第一附屬醫院