藏紅花素在制備預防及治療糖尿病周圍血管病變藥物中的用圖
【專利摘要】本發明公開了藏紅花素在制備預防及治療糖尿病周圍血管病變藥物中的用途，屬于醫藥技術領域。本發明針對藏紅花素具有改善糖尿病引起的血管內皮功能受損、緩解周圍血管病變的潛在治療作用進行研究，通過權威的離體血管張力檢測方法觀察藏紅花素對糖尿病模型血管的舒張能力影響，以及在細胞水平驗證其可能的作用機制，證實了藏紅花素具有明顯提高糖尿病血管舒張能力、保護血管內皮功能的潛在作用。本發明探索性發現藏紅花素具有治療糖尿病性周圍血管病變的作用，本發明的提出為臨床治療糖尿病性周圍血管病變提供了一種新的技術手段。
【專利說明】
藏紅花素在制備預防及治療糖尿病周圍血管病變藥物中的 用途
技術領域
[0001] 本發明涉及藏紅花素的新的治療用途，特別涉及藏紅花素在制備治療糖尿病周圍 血管病變藥物中的用途，本發明屬于醫藥技術領域。
【背景技術】
[0002] 糖尿病并發的周圍血管病變是糖尿病的重要并發癥之一，表現為閉塞性動脈硬化 引發的周圍組織中氧及營養物質的缺乏，進而發展的痛性痙攣和疼痛為特征的間歇性跛 行，發病機制以高血糖引起的血管內皮功能損傷為最初的病理改變。血管內皮的生理功能 是屏障、分泌和信息傳遞。內皮細胞作為血流和血管壁之間屏障，有選擇性通透功能，也有 合成分泌血管收縮因子、舒張因子及其它因子的功能。目前發現與內皮功能相關的血管舒 張因子有三種:N0、PGI 2和EDHF。而諸多疾病因素如高血糖、高血脂等常破壞血管內皮，異常 改變N0、PGI2和EDHF表達及活性，致使內皮功能受損，主要表現是內皮依賴性脈管舒張功能 減弱，對乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)的反應性降低，內皮通透性增加，NO合成減少等。內 皮功能受損后期常引發嚴重的心血管并發癥，加重了疾病的發展，可以說血管內皮功能受 損是心血管疾病發生的最初環節，是糖尿病周圍血管病變的關鍵過程。因此，在治療高血糖 過程中有效兼顧改善血管內皮功能將會起到事半功倍的治療效果。
[0003]藏紅花是一種鳶尾科番紅花種屬花卉植物，含有糖類、蛋白質、維生素、類黃酮、氨 基酸、天然礦物質及樹膠等多種成份，具有多種生物和藥理活性，被認為是一種名貴的中藥 材，其醫用價值被廣泛研究。藏紅花的提純物有三種:藏紅花素、藏紅花苦甙和藏花醛，其中 藏紅花素(crocin)被Alavizadeh SH，Rajaei Z等證實具有較為明確的抗氧化和抗腫瘤作 用。另有相關報道稱藏紅花素也具有保護心肌缺血損傷、抗高血壓、抑制動脈粥樣硬化等生 物學作用。具體如下:Goyal SN等通過異丙腎上腺素誘導的心肌梗死動物模型發現，口服藏 紅花素可以預防心梗發生，提高大鼠的生存能力;杜鵬等證實靜脈注射藏紅花素可以減小 心肌梗死面積，降低乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH)和肌酸激酶（creatine kinase，CK)的血清含量，治療心肌缺血損傷;Sheng L等發現藏紅花素可以通過抑制胰脂肪 酶的活性，降低甘油三酯（triglyceride,TG)、低密度脂蛋白（Low Density Lipoprotein, LDL)和膽固醇的血清含量，減少動脈粥樣硬化的發生。最近Razavi BM等發現，藏紅花素可 降低殺蟲劑二嗪農對血管的慢性損傷作用。諸多研究初步說明藏紅花素具有多種生物學作 用，但是對于藏紅花素在改善或修復糖尿病引發的血管內皮功能損傷以及治療糖尿病周圍 血管病變中的應用，目前沒有報道。本發明通過明確藏紅花素對糖尿病血管內皮功能的調 節作用，為糖尿病血管并發癥的對癥治療提供依據。

【發明內容】

[0004]本發明所要解決的技術問題是提供藏紅花素在制備治療糖尿病周圍血管病變藥 物中的用途。本發明發現了藏紅花素具有改善糖尿病性周圍血管內皮功能的作用，為其將 來用于臨床糖尿病周圍血管病變的治療提供一種新的技術手段。
[0005] 為了達到上述目的，本發明采用了以下技術手段：
[0006] 本發明首先確定了藏紅花素對血管張力的大體作用，即舒張功能，且初步明確了 該作用與內皮有直接的依賴關系。本發明通過比較靜息和收縮狀態下藏紅花素對血管環張 力的影響，發現藏紅花素有減弱PE(苯腎上腺素）的縮血管作用，推測出藏紅花素對病理因 素(糖尿病等）引起的血管縮窄有更直接的擴張作用。另外我們研究還發現，提前使用藏紅 花素可抵抗PE的縮血管作用，說明藏紅花素也具有降低或預防病理因素對血管破壞的風 險。其次檢測藏紅花素對糖尿病模型血管舒張能力的影響，發現藏紅花素可提高糖尿病血 管的舒張能力，有效減弱PE的縮血管作用。最后通過培養原代血管內皮細胞，觀察藏紅花素 對內皮功能相關蛋白eNOS(內皮一氧化氮合酶)的影響，結果表明藏紅花素可以提高eNOS的 表達水平以及磷酸化水平，eNOS表達及磷酸化水平增高導致內皮合成NO增多，最終引起血 管擴張。本發明的提出為藏紅花素在臨床糖尿病性周圍血管病變的預防和治療提供了新的 理論支持。
[0007] 在上述研究的基礎上，本發明提出了藏紅花素在制備預防及治療糖尿病周圍血管 病變藥物中的用途。
[0008] 在本發明中，優選的，所述的藥物具有提高糖尿病人血管舒張能力的作用。
[0009] 在本發明中，所述的藏紅花素通過提高eNOS的表達水平來達到提高糖尿病人血管 的舒張能力，進而達到預防或治療糖尿病周圍血管病變的目的。
[0010] 本發明探索性發現藏紅花素具有治療糖尿病性周圍血管病變的作用，本發明的提 出為臨床治療糖尿病性周圍血管病變提供了新的技術手段。
【附圖說明】
[0011] 圖1為去內皮后，不同濃度的藏紅花素對PE收縮的血管張力無影響；
[0012] T示加 PE后血管的張力，"▼"示加藏紅花素后血管的張力；
[0013] 圖2為在正常組和糖尿病模型組，各濃度藏紅花素均可使PE收縮的血管舒張，隨著 藏紅花素作用濃度的增加舒張率升高，呈劑量依賴性。
[0014] 圖3為藏紅花素抵抗PE的血管收縮作用；
[0015]在正常組和糖尿病模型組中，用藏紅花素預孵育血管環后，不同濃度PE的血管收 縮作用均明顯下降；
[0016] 圖4為Western blotting法檢測藏紅花素對eNOS表達的影響；
[0017] 藏紅花素有上調總eNOS(t-eNOS)表達及提高eNOS的磷酸化水平(ρ-eNOS)的作用； [0018]圖5為對圖3結果的統計分析。
[0019] a圖表示藏紅花素促進p-eNOS表達上調，b圖表示藏紅花素促進t-eNOS表達上調。
【具體實施方式】
[0020]下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應 該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修 改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
[0021] 實施例1藏紅花素對動脈環張力的影響
[0022] 1、糖尿病大鼠模型的制備
[0023] (1)選雄性SD大鼠，體重180-220g，月齡4-6周。常規飼料、自由飲水飼養一周。
[0024] (2)禁食(不禁水)過夜，尾靜脈測空腹血糖，稱體重。
[0025] (3)用無菌的0 · IM檸檬酸緩沖液(PH = 4 · 2)配制1 %的STZ(即用即配），按照60mg/ kg用量一次性腹腔注射。注射后每日給予充足的食物和水，勤換墊料，保持干燥環境。
[0026] (4)注射后7天空腹血糖達16.7mmol/l為穩定模型，進入下一步實驗。
[0027] 2、離體微血管張力測試
[0028] (1)模型鼠麻醉后，分離主動脈，快速置于預冷的Krebs溶液中，并持續通入混合氣 體95%〇2和S^CO2t3Krebs溶液成份(mmol/L):NaCl 120;NaHC03 25;KC1 4.8;NaH2P〇4 1.2; MgS〇4 1.2;Glucose 11.0;CaCl2 1·8〇
[0029] (2)清除血管周圍的結締組織，切成2mm長的血管環，穿過兩根金屬絲固定于微血 管張力檢測儀的Krebs溶液浴槽中，浴槽內持續通入95 % O2和5 % CO 2的混合氣體，恒溫于37 °C平衡20min，調節血管環靜息張力，Krebs溶液平衡2h，每20min換液一次。
[0030] (3)用ΙμΜ去氧腎上腺素（PE)預收縮血管環，收縮峰值達15min后，加入乙酰膽堿 (Ach，ΙΟμΜ)使預收縮的血管環舒張超過80%，可認為血管內皮完整，可進行后續實驗。
[0031] (4)ΡΕ再次預收縮血管環，用梯度乙酰膽堿(Ach，0.1nM-10yM)舒張血管環，作劑 量-舒張反應曲線。以PE誘發的最大收縮幅度為100%，計算藏紅花素孵育后血管張力幅度 與PE誘發的最大收縮幅度比率，以此來反應血管張力的變化，評價藏紅花素對血管內皮舒 張反應的調節作用。
[0032] 第一、實驗分別檢測藏紅花素對動脈環靜息狀態下和收縮狀態下張力的影響，確 定藏紅花素對血管張力的大體作用。
[0033] 第二、實驗中設計血管去內皮組（用特制毛刷去除血管內皮)和內皮完整組，評估 藏紅花素對血管環舒張能力的影響，且證實是否為內皮依賴型的調節作用。
[0034]第三、比較正常血管和糖尿病模型血管在PE處理后Ach的擴血管作用，證實糖尿病 性血管損傷模型建立完成，為下一步實驗奠定基礎。
[0035]第四、檢測藏紅花素對血管環舒張功能的影響。正常組和糖尿病模型組動脈血管 環先用PE(l(T5m〇l/L)使其收縮張力達到平臺，此后累積加入梯度濃度的藏紅花素（10- 9m〇l/L-l(T5m〇l/L)，觀察血管環的張力的變化，并計算舒張率。
[0036] 第五、檢測藏紅花素對抗PE的血管收縮作用。先給藏紅花素（l(T6m〇l/L)預孵育 20min后再累積加入不同濃度梯度的PE(l0- 9mol/L-l0-5mol/L)，分析藏紅花素對血管的舒 張能力的調節作用。
[0037] 3、結果
[0038] (1)藏紅花素累積給藥前后的終張力對靜息主動脈環張力無顯著影響，隨著藏紅 花素濃度的逐漸增大，藏紅花素顯示了輕微的血管舒張作用;但用PE預收縮血管后，藏紅花 素可明顯舒張血管，說明藏紅花素對靜息狀態下主動脈環張力無顯著性影響，但對已處于 收縮狀態的血管有較好的舒張作用，推測藏紅花素對病理因素(糖尿病等）引起的血管縮窄 有更直接的擴張作用。
[0039] (2)在去內皮組各個濃度的藏紅花素均不能改變血管張力幅度(如圖1)，而在內皮 完整組藏紅花素可降低PE收縮血管的張力，說明藏紅花素的擴血管作用依賴于血管內皮。 [0040] (3)正常組和糖尿病模型組預先均用PE(l(T5m 〇l/L)收縮血管，張力達到平臺后，累 積加入不同濃度的藏紅花素，發現各組血管張力均有下降，血管舒張率增加（如圖2)，說明 藏紅花素對正常血管和糖尿病血管在其收縮狀態下均有舒張作用。另外，實驗結果還發現 藏紅花素對正常血管的舒張作用要強于糖尿病血管，這也從另一角度說明了本實驗中糖尿 病確實對血管有所損傷，并影響了血管內皮依賴性的擴張作用。但在本研究中藏紅花素對 糖尿病血管的舒張率可達54.44% (表1所示），這也充分證明了藏紅花素的作用效果。
[0041 ] 表1藏紅花素對大鼠胸主動脈環舒張效應的影響（％± s,n = 6)
[0043] (4)用藏紅花素分別預處理正常組和糖尿病模型組血管20min后，各濃度PE對血管 的收縮能力下降(如圖3)，說明藏紅花素具有抵抗PE的血管收縮作用。
[0044] 實施例2藏紅花素對HUVECs中eNOS表達的影響
[0045] 1、細胞培養
[0046] 人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)用含5%FBS、1%ECGS的ECM培養液培養，37°C、5%⑶2 及飽和濕度的條件下實驗，所有實驗過程使用中的細胞為3-10代，細胞培養過程中嚴格按 照無菌操作原則進行。實驗過程中取用對數生長期的細胞，分別給予藏紅花素(〇.1μΜ、1μΜ、 10μΜ、100μΜ 和 ΙΟΟΟμΜ)孵育 48h。
[0047] 2、western blotting分析
[0048] 提取細胞總蛋白，western blotting分析p-eN0S、t_eN0S和β-actin表達變化情 況，具體操作步驟如下：
[0049] (1)細胞總蛋白的提取：用預冷的PBS漂洗藏紅花素孵育后的HUVEC細胞二次，每個 孔中加入80μ1蛋白裂解液，在冰上邊裂解邊搖勻30min。用細胞刮將加有蛋白裂解液的細胞 刮下，并轉移至經過冷卻的離心管中，于12000rpm離心5min。小心取上清即為細胞總蛋白。 上清液轉移分裝于離心管中，存于_80°C備用。
[0050] (2)蛋白濃度測定:依照蛋白定量試劑盒說明書進行。
[0051 ] (3)將提取的蛋白加入1 /4體積5 X電泳加樣緩沖液，混勻后置入100 °C水中加熱 5min，使蛋白變性，再迅速將加熱的蛋白樣本置于冰上。根據測定的蛋白樣本濃度，上樣量 經過調整，電泳槽中每孔加約IOOyg蛋白量，采用預染marker做分子參照，電泳初始電壓設 為70V，待樣本進入濃縮膠與分離膠交界后改電壓為120V。
[0052] (4)轉膜，恒定電流250mA轉膜1-2h(根據分子量大小）。轉膜結束后，硝酸纖維素膜 置入TBST緩沖液中短暫漂洗后，放入封閉奶粉中室溫下溫和振蕩lh。把膜放入稀釋的一抗 (見下表2)中，4°C過夜。
[0053]表2-抗、二抗的稀釋濃度
[0055] (5)回收一抗，在TBST液中洗膜3次，每次lOmin，然后把硝酸纖維素膜置于稀釋的 二抗(見表2)中室溫下溫和振蕩Ih(避光），后在TBST中洗膜3次，每次lOmin。
[0056] (6)曝光、顯影及定影:取ECL試劑A和試劑B適量，混合Imin后均勻滴加于硝酸纖維 素膜上，用食物保鮮膜覆蓋硝酸纖維素膜后放入膠片盒，在暗室內同時放入X光膠片并作方 向標記，曝光，洗片。根據曝光的情況調整曝光時間。用底片掃描儀掃描光膠片，通過凝膠成 像系統或Quantity one 4.6.2分析軟件讀取目的電泳條帶的密度掃描值，并分析。
[0057] 2、結果
[0058]蛋白檢測發現，藏紅花素可以提高eNOS的表達水平以及磷酸化水平（圖4)，說明藏 紅花素的血管作用與提高eNOS的磷酸化有關，eNOS表達及磷酸化水平增高，內皮合成NO增 多，最終引起血管擴張。
[0059]綜上，本發明通過比較靜息和收縮狀態下藏紅花素對血管環張力的影響，發現藏 紅花素有減弱PE的縮血管作用，推測出藏紅花素對病理因素(糖尿病等）引起的血管縮窄有 更直接的擴張作用。進一步的實驗證實，藏紅花素可明顯降低PE對糖尿病血管的收縮作用， 尋其機制發現或許與其提高eNOS表達和磷酸化水平，進而改善血管內皮功能有關。另外研 究還發現，提前使用藏紅花素可抵抗PE的縮血管作用，說明藏紅花素也具有降低或預防病 理因素對血管破壞的風險。本發明的提出為臨床糖尿病性周圍血管病變的預防和治療提供 了新的技術手段。
【主權項】
1. 藏紅花素在制備預防及治療糖尿病周圍血管病變藥物中的用途。2. 如權利要求1所述的用途，其特征在于所述的藥物具有提高糖尿病人血管舒張能力 的作用。3. 如權利要求2所述的用途，其特征在于所述的藏紅花素通過提高eNOS的表達水平來 達到提高糖尿病人血管舒張能力，進而達到預防或治療糖尿病周圍血管病變的目的。
【文檔編號】A61P3/10GK106074477SQ201610415865
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月7日 公開號201610415865.3, CN 106074477 A, CN 106074477A, CN 201610415865, CN-A-106074477, CN106074477 A, CN106074477A, CN201610415865, CN201610415865.3
【發明人】楊慧科, 呂艷華, 趙玉嬌, 肖建兵, 楊樹才, 李雪梅, 李鑫磊, 李曉冬, 馬晶, 張雅芳
【申請人】哈爾濱醫科大學