灰葉酸抑制真核細胞線粒體atp生成的應用
【專利摘要】本發明公開了一種灰葉酸抑制真核細胞線粒體ATP生成的應用；灰葉酸作為真核細胞線粒體膜電位抑制劑的應用；灰葉酸作為線粒體氧化磷酸化抑制劑的應用。本發明提出了灰葉酸的新用途，這些用途基于其新的功能發現和證實。灰葉酸可劑量依賴性和時間依賴性地降低多種細胞的線粒體膜電位，細胞的ATP水平也隨之下降，細胞的活性顯著降低并最終死亡。
【專利說明】
灰葉酸抑制真核細胞線粒體ATP生成的應用
技術領域
[0001]本發明屬于灰葉酸應用技術領域，具體涉及一種灰葉酸抑制真核細胞線粒體ATP 生成的應用。【背景技術】
[0002]線粒體是細胞內負責能量生成的細胞器，對于細胞的功能狀態至關重要。線粒體通過氧化磷酸化的方式把來源于葡萄糖和脂肪酸等產生的乙酰輔酶A通過三羧酸循環生成 C02,同時把氫離子通過遞氫體沿呼吸鏈傳遞，在此過程中建立線粒體內膜兩側的氫離子濃度差，并將此勢能差用于ATP生成。氫離子最后氧化生成水。線粒體膜電位是維持ATP生成的能量來源，膜電位消失將導致ATP生成減少，進而導致細胞因能量缺乏而死亡。
[0003]灰葉酸(grifolic acid)屬于酸類化合物，被作為游離脂肪酸受體激動劑或者詰抗劑而使用，通過檢索國內外現有技術，尚未有文獻報道灰葉酸的其它生物學效應。
【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種灰葉酸抑制真核細胞線粒體ATP生成的應用，為抑制癌細胞的增殖提供了新的思路。
[0005]本發明所采用的技術方案是，灰葉酸抑制真核細胞線粒體ATP生成的應用。
[0006]灰葉酸作為真核細胞線粒體膜電位抑制劑的應用。
[0007]灰葉酸作為線粒體氧化磷酸化抑制劑的應用。
[0008]本發明的有益效果是，本發明提出了灰葉酸的新用途，這些用途基于其新的功能發現和證實。灰葉酸可劑量依賴性和時間依賴性地降低多種細胞的線粒體膜電位，細胞的 ATP水平也隨之下降，細胞的活性顯著降低并最終死亡。【附圖說明】
[0009]圖1:灰葉酸降低真核細胞的線粒體膜電位:共聚焦顯微鏡拍攝人L2肝細胞的JC-1 熒光強度的變化過程，分別為加藥前(A)和20mi〇1/L灰葉酸處理5分鐘(B)、10分鐘(C)、20分鐘(D)之后熒光強度變化;共聚焦顯微鏡拍攝小鼠Raw264.7巨噬細胞的JC-1熒光強度的變化過程，分別為加藥前(E)和20wnol/L灰葉酸處理5分鐘(F)、20分鐘(G)、30分鐘(H);A-H圖中的1號為585nm激光下熒光強度，2號為514nm激光下熒光強度；
[0010]圖2:灰葉酸降低真核細胞的線粒體膜電位的統計結果;不同細胞在不同濃度灰葉酸處理5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘和60分鐘之后，細胞內JC-1紅色熒光與綠色焚光比值相對于加藥前的變化比例;A:人L2肝細胞;B:人胚腎HEK293細胞;C:人MCF-1乳腺癌細胞;D:大鼠GH3垂體細胞;E:大鼠腎NRK細胞;F:小鼠Raw264.7巨噬細胞，每組細胞數目n = 100;[〇〇11]圖3:灰葉酸減少真核細胞的細胞ATP水平;20wi1l/L灰葉酸處理0.5小時后各種細胞的胞內ATP水平顯著下降，并隨時間延長至2小時后降低幅度顯著增加(圖A);10mi〇1/L灰葉酸處理2小時和6小時后各種細胞的胞內ATP水平時間依賴性出現下降(圖B)，每組細胞數 n = 12；[〇〇12]圖4:灰葉酸誘導真核細胞死亡;不同細胞在不同濃度灰葉酸處理2小時、6小時、12 小時和24小時之后，經MTT檢測發生死亡的情況。A:人L2肝細胞;B:人胚腎HEK293細胞;C:人 MCF-1乳腺癌細胞;D:大鼠GH3垂體細胞;E:大鼠腎NRK細胞;F:小鼠Raw264.7巨噬細胞;灰葉酸劑量依賴性和時間依賴性促進上述各種細胞的死亡，每組細胞數n = 16。【具體實施方式】
[0013]下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。
[0014]一、細胞培養:人、大鼠和小鼠來源的多種細胞用于灰葉酸作用的檢測。人L2肝細胞、人MCF-1乳腺癌細胞、人胚腎HEK293細胞、大鼠GH3垂體細胞、大鼠腎NRK細胞、小鼠 Raw264.7巨噬細胞等用于檢測。上述所有細胞均培養于含10 %胎牛血清的DMEM培養液中， 在37 °C的5 % C02培養箱中培養，每2-3天更換培養液，細胞生長至80 %后傳代。傳代用 0.25 %胰蛋白酶+0.02 % EDTA消化后按照1: 3?5比例傳代。培養液和血清以及消化酶均為 Gibco公司產品。[〇〇15]二、細胞線粒體膜電位檢測:將上述所有細胞種植于0.01 %多聚賴氨酸包被的蓋玻片上，第二天換至無血清培養液，培養液中加入JC-1 (終濃度5yg/ml)進行負載20分鐘，隨后清洗去培養液中JC-1。細胞放置于共聚焦顯微鏡上，連續定時觀察JC-1的熒光強度變化。 JC-1熒光探針在線粒體膜電位較高時，可聚集在線粒體的基質中，形成聚合物，產生紅色熒光;JC-1在線粒體膜電位較低時，不能聚集在線粒體的基質中，此時成為單體，產生綠色熒光。這樣就可通過紅綠熒光的相對比例來衡量檢測線粒體膜電位的變化。JC-1熒光強度記錄圖如圖1所示，由圖1可見JC-1熒光強度隨灰葉酸處理時間延長而在585nm出現下降，在 514nm出現增強，說明JC-1從線粒體漏出到細胞漿內，說明細胞的線粒體膜電位下降。
[0016]對每個細胞的熒光強度進行測量后進行比值分析，采用方差分析對各組間熒光比值進行統計學分析。結果如圖2所示。例如，在人L2肝細胞，灰葉酸在20wn〇l/L的濃度處理5 分鐘后，細胞即可出現顯著的JC-1紅色熒光強度減弱，綠色熒光強度增強，說明線粒體膜電位開始減小。20wi1l/L灰葉酸處理30分鐘后，JC-1紅綠熒光比值降至最低。lOwnol/L灰葉酸在處理5分鐘后起效，并隨時間延長而效果更加明顯，其消除線粒體膜電位的作用較20y mol/L灰葉酸為弱。5ymol/L灰葉酸在10分鐘后起效，其削弱線粒體膜電位的作用較lOymol/ L灰葉酸為弱。2.5m1 1 /L灰葉酸的作用則進一步減弱，1.2 5m〇 1 /L灰葉酸在1小時之內未見對線粒體膜電位有顯著的影響。雖然灰葉酸在不同細胞的作用效果有所不同，但是在2.5y mol/L及以上的濃度下，灰葉酸在所測試的細胞均有降低線粒體膜電位的作用，且作用具有時間依賴性和劑量依賴性。
[0017]三、細胞內ATP水平檢測:上述所培養的各種細胞種植于24孔培養板中，待生長至 90 %之后，更換至無血清培養液，分別加入不同濃度灰葉酸，在作用0.5小時、2小時、6小時后去除上清液，加入細胞裂解液。冰冷狀態下裂解收取細胞液，用于ATP水平測定。[〇〇18] ATP水平采用化學發光法測定，具體步驟如下:在化學發光板中每孔加入lOOiil的 ATP檢測工作液，室溫放置5分鐘，隨后用排槍迅速分別在每孔加入檢測樣本或者標準品20y1，放置20秒后，放置于化學發光儀上測定發光亮度。根據標準曲線計算各個樣本的ATP水平，進行統計學分析。[〇〇19] 具體結果如圖3所示。20wi1l/L灰葉酸作用0.5小時后，在人L2肝細胞即可見到顯著的ATP水平下降，2小時后更為明顯。1 Owno 1 /L灰葉酸的作用較20m1 1 /L灰葉酸為弱，在2 小時也可引起顯著ATP水平下降，在6小時后作用更為明顯。
[0020]四、細胞活性檢測:上述所培養的各種細胞種植于96孔培養板中，待生長至90%之后，更換至無血清培養液，分別加入不同濃度灰葉酸，孵育2小時、6小時、12小時、24小時。隨后加入MTT(終濃度0.5mg/ml) JTT可透過細胞膜進入細胞內，活細胞線粒體中的琥珀脫氫酶能使外源性MTT還原為難溶于水的藍紫色的針狀結晶并沉積在細胞中，結晶物能被DMS0 溶解，用酶聯免疫檢測儀在560nm波長處測定其光吸收值，可反映細胞數量。在MTT孵育4小時后，完全去除上清液，每孔加入l〇〇yl的DMS0,應用酶標儀在560nm處讀取吸光度(0D值)。 采用方差分析對各組的0D值進行統計學分析。具體結果如圖4所示。灰葉酸自2.5wn〇l/L至 20wii〇l/L以劑量依賴性和時間依賴性方式顯著降低所有檢測的細胞的活性。
【主權項】
1.灰葉酸抑制真核細胞線粒體ATP生成的應用。2.灰葉酸作為真核細胞線粒體膜電位抑制劑的應用。3.灰葉酸作為線粒體氧化磷酸化抑制劑的應用。
【文檔編號】A61P43/00GK106074475SQ201610364908
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年5月27日
【發明人】趙玉峰, 王莉, 蘇興利, 徐曦, 劉珂, 陳鏑, 劉英光, 謝榮, 梁向燕
【申請人】西安醫學院