積的GTE Buffer(50mM葡萄糖，20mMρΗ7·5Tris-HCl，10mMEDTA，2mg/mL溶菌酶）中，37°C處理 30 分鐘用以破壞營養細胞，12000rpmXlOmin沉淀芽孢，用pH7. 4的PBS洗3次后重懸于相同 體積的SDS-DTT緩沖液（0·ImMpH7. 4PBS，50mMDTT，1. 5%SDS)中，65°C水浴處理 10min， 進行SDS-PAGE電泳，轉移到PVDF膜上，以兔抗Flag血清為一抗，Westernblot檢測重組 菌株和野生型菌株的芽孢蛋白。結果顯示：野生型菌株48h和重組菌株8h的培養物中都沒 有檢測到NP，而重組菌株培養48h后，由于營養耗盡，細胞分化形成芽孢，在芽孢形成的過 程中，NP隨著芽孢衣殼蛋白CotC-同得到表達，因而能檢測到NP，見圖6。這表明重組芽 孢中營養多肽NP通過衣殼蛋白載體CotC將其展示在了重組芽孢的表面。
[0035] 實施例3:小鼠口服重組芽孢提高運動效率的功能分析 本實驗選用5周大的健康ICR小鼠（20 - 25g)進行口服芽孢實驗。實驗小鼠完全按 照揚州大學實驗動物中心的要求和指導進行飼養。飼養溫度控制在25 土 1°C，提供充足的 飲用水。在正式實驗之前預先進行芽孢的急性毒理實驗。選取5只小鼠，按5mg/克體重 的劑量一次性給小鼠口服重組芽孢，然后觀察一周，發現小鼠一切生理活動正常后進行下 一步實驗。
[0036] 取46只ICR小鼠（20 - 25g)，由揚州大學動物中心提供。隨機分成5組，對照組 6只，其他組10只。正常組；運動對照組（口服生理鹽水）；運動野生型處理組（口服野生型 菌株的芽孢，一次灌胃劑量為2mg/克體重）;運動轉基因重組芽孢處理組(一次灌胃劑量2 mg/克體重)。小鼠飼料由南通特洛菲飼料科技有限公司提供。所有小鼠在溫度25 土 1°C， 濕度40-60%自然光照下按組分籠飼養，提供充足的飲用水。每周固定時間稱大鼠體重。小 鼠適應性游泳3天后，運動組采用無負重游泳運動，每天1次，每次2小時，持續2周。運動 時間安排在下午進行。游泳池為100cmX70cmX60cm的長方體，水深50cm，水溫32± 1°C。 小鼠在適應性游泳運動時，每天上午進行灌胃一次，灌胃劑量為2mg/克體重。運動對照組 (E)給予相等體積的生理鹽水。
[0037] 動物末次鍛煉結束后，禁食12小時，第二天按50mg/kg的劑量腹腔注射1%的戊巴 比妥納麻醉，然后從眼球取血，注入EP管中，常溫靜置1小時后，3000rpm/min離心15min 后，分離血清，保存于-20°C冰箱。
[0038] 隨后進行血清的各項生理指標進行檢測，主要包含琥珀酸脫氫酶（SDH)、血尿素， 接著進行統計學的t檢驗分析來比較各組生理指標的變化，見下表1和表2,表1為口服重 組芽孢對運動模型小鼠珀酸脫氫酶（SDH)影響的結果；表2為口服重組芽孢對運動模型小 鼠血尿素（BUN)含量的變化。
[0039] 說明口服重組芽孢可以迅速補充人體必需氨基酸的原料，來滿足合成機體劇烈運 動所需的大量能量物質，這樣便增加了三羧酸循環能量代謝中最關鍵酶SDH的能量代謝活 性，來提高有氧運動能力，同時有利于降低BUN維持肌肉中能量平衡。
[0040] 表1. 口服重組芽孢對運動小鼠琥珀酸脫氫酶（SDH)變化
與正常比較*P〈〇.05;與運動對照組比較#p〈0. 05, ##p〈0. 01; 表2. 口服重組芽孢對運動對小鼠尿素（Urea)的影響
與正常組比較#P〈〇.01 ;與運動對照組比較#P〈〇.05, ##p〈0. 01 實施例4: 口服重組芽孢對運動小鼠血睪酮（T)影響 血睪酮促進體內的合成代謝，有利于提高力量、速度、耐力的訓練效果。一般來說身體 機能良好時血睪酮水平變化不大，且有體能增強伴有血睪酮增加的趨勢。而在疲勞過度訓 練或機能狀態不好時血睪酮水平則會下降。
[0041] 實驗步驟同實施例3,實驗結果分析如下： 運動對照組的血睪酮顯著高于對照組，說明小鼠對該運動強度適應良好，這與大部分 研究認為適應運動量可是血睪酮增加的理論相一致。重組芽孢組較運動對照組增加，并且 具有顯著性差異，說明重組芽孢可以升高血睪酮的含量。睪酮是人體內一個重要的促合成 激素，它不僅可以維持男性性功能和副性特征，而且它還刺激組織攝取氨基酸，而口服重組 芽孢則恰好滿足了機體對必須氨基酸的需要，作為補充原料來促進核酸與蛋白質的合成， 促進肌纖維和骨骼的生長，促進腎臟促紅細胞生成素的生成，增加肌糖原儲備，增強免疫功 能。
[0042] 表3. 口服重組芽孢對運動對小鼠血睪酮（Τ)影響
與正常組比較**ρ〈0. 01;與運動對照組比較##ρ〈0. 01。
【主權項】
1. 一種口服重組營養多肽的制備方法，其特征在于，利用枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白 基因CotC為分子載體，與帶有腸激酶標簽的營養多肽基因np重組，構建融合表達的整合型 重組質粒PJS700-NP，并轉化枯草芽孢桿菌獲得枯草芽孢桿菌重組菌株，誘導重組菌株產生 重組芽孢，在重組芽孢表面展示有重組營養多肽。2. 根據權利要求1所述的一種口服重組營養多肽的制備方法，其特征在于，所述營養 多肽基因np包括人體必需八種氨基酸(賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、異亮 氨酸、亮氨酸、纈氨酸）的基因片段。3. 根據權利要求2所述的一種口服重組營養多肽的制備方法，其特征在于，所述營養 多肽基因np包括BCAA(支鏈氨基酸）基因片段。4. 根據權利要求1所述的一種口服重組營養多肽的制備方法，其特征在于，所述擴增 基因編碼序列片段的特異性引物序列為： Np-F： 5 '-GGGGTACCCCgACGATGACGATAAGCTGAAGGTGACCATCAAGAC-3， 其中，單下劃線表示限制性內切酶ΚρηI，雙下劃線表示腸激酶的識別位點； Np-R： 5_'CGGAATTCCGTCACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCCTTGGTCACCAGCAGGAT CAC-3' 其中，單下劃線表示限制性內切酶EcoRI，雙下劃線表示Flag標簽。5. -種整合型重組質粒，其特征在于，所述重組質粒編碼含有腸激酶標簽的融合蛋白 CotC-NP〇6. 一種重組菌株168 /pJS700_NP，是由權利要求6所述的整合型 重組質粒PJS700-NP轉化枯草芽孢桿菌得到的重組菌株，所述重組菌株誘導形成的芽孢表 面展示有重組營養多肽。7. -種枯草芽孢桿菌重組芽孢，是由權利要求7所述的重組菌株你ciWys 168 /pJS700-NP誘導形成的重組芽孢，其表面展示有帶有腸激酶標簽的融合蛋白CotC-NP，NP為營養多肽。8. 如權利要求7所述的重組芽孢在制備營養保健食品中的應用。9. 根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所述營養保健食品為口服運動型保健食 品。10. 根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所述營養保健食品為口服補充人體必需 氨基酸類保健食品。
【專利摘要】本發明涉及一種補充人體必需氨基酸的口服重組營養多肽的制備方法，屬于重組融合蛋白藥物技術領域；本發明將帶有腸激酶標簽的營養多肽基因np整合到pJS700載體上，然后用芽孢衣殼蛋白基因cotC作為分子載體，構建融合表達的整合型重組質粒，將其轉化枯草芽孢桿菌，使外源基因整合于染色體上的淀粉酶基因中，并篩選出含融合表達cotC-NP的重組枯草芽孢桿菌菌株，誘導重組菌株產生的芽孢表面展示營養多肽；本發明構建的表面展示帶有腸激酶標簽營養多肽的重組芽孢，可用于動物、人直接口服在腸道進行自由消化吸收，成為一種新型的口服運動營養保健品，具有廣泛的應用價值；克服了BCAA來源于化學合成提取的限制，也克服了重組發酵生產營養多肽分離純化過程復雜的缺點。
【IPC分類】C12R1/125, C12N1/21, A23L33/18, C12N15/75
【公開號】CN105349566
【申請號】CN201510793140
【發明人】陳克平, 馮凡, 陳美萍, 陳亮, 呂鵬, 張春霞, 陳先濤, 姚勤, 夏恒傳, 馬上上
【申請人】江蘇大學
【公開日】2016年2月24日
【申請日】2015年11月18日