) 步驟（2)得到的重組質粒pMD18-T-NP和質粒pJS-700經過雙酶切將營養多肽基因 λ/插入到原核表達質粒pJS700的你/?1和酶切位點之間，構建好帶有人體腸道能夠 自由消化吸收腸激酶標簽Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的整合型重組質粒pJS700-NP，用該質粒 轉化枯草芽孢桿菌168)，采用耗竭法誘導宿主菌產生芽孢，在芽孢表 面展示有帶有腸激酶標簽的融合蛋白CotC-NP。
[0008] 本發明中選擇具有良好的轉化能力并且可以產生芽孢的枯草芽孢桿菌菌株為 重組質粒的轉化菌株，例如ifeciWiAs 168及其衍生的一系列菌株（Bacillus GeneticStockCenter,DepartmentofBiochemistry,TheOhioStateUniversity,West12thAvenue,Columbus,Ohio, 43210,USA)； 選擇芽孢衣殼蛋白基因co冗（GeneBank序列號：NP_389653)作為表面展示蛋白的分 子載體。
[0009] 枯草芽孢桿菌為環境友好型細菌，其在營養缺乏時會分化形成休眠體芽孢，芽孢 具有極強的抗逆性，可以耐酸和堿，存活能力較強，并且其比重大，容易進行分離純化。枯草 芽孢桿菌的培養方法簡單方便，生長迅速，營養要求簡單，容易進行工業放大培養。在枯草 芽孢桿菌的芽孢表面展示帶有腸激酶標簽的營養多肽，使營養多肽蛋白獲得快速大量表達 的同時具有良好的抗逆性和人體腸道自由消化吸收的穩定性，并且分離純化簡便快捷。
[0010] 本發明還提供一種本發明中所選擇的芽孢衣殼蛋白基因m忙與/7/基因編碼序列 重組后構建的重組質粒，在此重組質粒中含有芽孢衣殼蛋白基因的啟動子、不含終止密碼 子的編碼序列與基因的編碼序列重組后的基因，可在枯草芽孢桿菌分化形成芽孢時融 合表達CotC-NP。通過構建帶有人體腸道自由消化吸收腸激酶標簽的整合型重組質粒，使得 融合基因整合于枯草芽孢桿菌染色體上的特定位點并穩定的進行遺傳，避免了質 粒在枯草芽孢桿菌細胞中容易丟失的缺點。
[0011] 帶有融合表達蛋白CotC-NP的表達載體可以通過熱擊法或電穿孔法轉化宿主細 胞，成功轉化的細胞，通過進一步篩選帶有本發明構建的融合基因的細胞，可以通過本領域 熟知的方法加以鑒定，如收集細胞，裂解后提取DNA，然后進行PCR鑒定等，也可以在誘導表 達后用NP抗體進行westernblot檢測。
[0012] 本發明還提供一種本發明構建的融合表達CotC-NP的重組整合型質粒轉化枯草 芽孢桿菌篩選所得到的重組菌株，這些重組菌株誘導形成的芽孢表面展示有重組營養多 肽，并可以通過Westernblot檢測其芽孢表面展示的重組多肽NP。
[0013] 本發明中所涉及的基因編碼序列片段克隆的引物序列為： Np-F(SEQIDNO. 2)： 5 ' -GGGGTACCCCGACGATGACGAr^6CTGAAGGTGACCATCAAGAC~3， 其中，單下劃線表示限制性內切酶KpnI，雙下劃線表示腸激酶的識別位點； Np-R(SEQIDNO. 3)： 5-'CGGAATTCCGTCACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTOCTTGGTCACCAGCAGGATCAC-3' 其中，單下劃線表示限制性內切酶EcoRI，雙下劃線表示Flag標簽； 本發明中涉及的枯草芽孢桿菌淀粉酶基因a?成（GeneBank序列號：NP_388186)片段 擴增的引物序列： amyE-F：ATTGCTCGGGCTGTATGACTGG(SEQIDNO. 4)amyE-R：GTTACACCATCACTGTTCGTTCCTT(SEQIDNO. 5) 本發明的突出優點表現為： 將營養多肽展示在枯草芽孢桿菌表面，利用芽孢所具有的獨特抗逆性，使得 營養多肽蛋白順利通過動物體消化屏障。本發明構建的表面展示帶有腸激酶標簽 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys營養多肽的枯草芽孢桿菌重組芽孢，可用于動物、人直接口服在腸道 進行自由的消化吸收，成為一種新型的口服運動營養保健品，具有廣泛的應用價值和廣闊 的市場價值。這種產品的發明克服了當前BCAA來源于化學合成提取的限制，降低了支鏈氨 基酸的生產價格，同時也克服了重組發酵生產的營養多肽分離純化過程復雜的缺點。
【附圖說明】
[0014] 圖1為本發明克隆的營養多肽基因編碼序列在expasy中搜索比對相應氨基酸 結果。大寫三字母字母表示基因對應編碼氨基酸的密碼子，有小寫的三字母表示氨基酸 序列，中文字體表示人體消化道中所存在的消化酶的酶切多肽的方式。
[0015] 圖2為融合表達CotC-NP整合型重組質粒PJS700-NP的構建方法及其結構圖譜。 其中，5' -end和3' -end分別表示淀粉酶基因編碼序列的5'端和3'端，通過同 源重組整合在168 (?τρ)染色體的淀粉酶基因中；辦別表示 氨節青霉素抗性基因和紅霉素抗性基因，在大腸桿菌和SaciWiAs· 168 (?τρ)中 作為篩選標記。Enterokinase表示腸激酶消化的標簽位點Asp-Asp-Asp-Asp-Lys。coif-/?/? 為在168 (?τρ)的芽孢中融合表達CotC-NP重組蛋白的基因片段，該 片段含有基因的啟動子序列、不含有m仏終止密碼子的CotC編碼序列，以及NP的全 部編碼序列；oriC為大腸桿菌復制子片段。
[0016] 圖3為重組菌株ifeciWiAs 168 (irp)/pJS700-NP的淀粉酶活性分析結 果。其中，A:野生型菌株ifeciUiA? 168 (?τρ)和重組菌株ifeciUiA? 168 (?ιρ) /pJS700-NP于淀粉平板上培養；B:在淀粉平板上野生型菌株和重組菌株的碘液 染色。
[0017] 圖 4 為 基因片段在ifeciUiA? 168 (?τρ)染色體中的整 合示意圖。
[0018] 圖5為PCR檢測重組菌株中的及Z-co忙-耶片段。其中，M:250bpDNALadder Marker;分別以 168 (?τρ) (Wild-type,WT)和 168 (irp)/pJS70〇-NP(Transgenic,TG)的染色體為模板，以amyE_F/amyE-R、np-F/np-R、np-F/amyE-R和amyE-F/np-R為四組引物對（引物對的在染色體中的位置見附圖 4)進行PCR鑒定重組基因。
[0019] 圖6轉基因重組菌株表面展示NP重組芽孢的westernblot鑒定。其中，Μ:蛋 白預染Marker;泳道1 :野生型菌株Β.subtilis168 (trp_)(陰性對照）；泳道2 :不含 Flag標簽的B.subtilis168 (trp-)/pJS700-Np重組菌株（陽性對照）；泳道3 :不含Flag 標簽的Β·subtilis168 (trp-)/pJS700-Bs重組菌株（陽性對照）；泳道4 :用鼠抗Flag抗 體檢測到的重組菌株融合蛋白cotC-Np;泳道5 :重復用鼠抗Flag抗體檢測到的重組菌株 融合蛋白cotC-Np。
【具體實施方式】
[0020] 以下結合具體實施例和附圖對本發明進一步說明。
[0021] 實驗材料： 各種限制性內切酶、T4DNAligase、L4raw 酶，PMD18-T載體均購至寶生物工程 (大連）有限公司，PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，測序由百奧邁科（Biomics) 生物技術有限公司完成，用于本發明的所有DNA片段的回收均采用OmegaBio-TekGel ExtractionKit分離純化，大腸桿菌菌株DH5a(中國普通微生物保藏管理中心CGMCC，北 京市朝陽區北辰西路1號院，中科院微生物研究所，100101)為本實驗室保存，其它試劑均 為國產分析純。
[0022] 在本發明中所使用的術語，非特別說明的情況下，一般為本領域普通技術人員所 理解的含義。以下實施例中未作具體說明的實驗操作方法均參照《分子克隆實驗指南》 (Sambrook等編著，科學出版社，1992年版)、試劑盒說明書、及產品說明書進行。以下的實 施例只是為了舉例說明本發明，并非以任何方式限制本發明的范圍。在以下實施例中，未詳 細描述的一些過程和方法都為本領域技術人員熟悉和了解的常