專利名稱：一種基于分子印跡整體柱的l-苯丙氨酸的分析檢測方法
一種基于分子印跡整體柱的L-苯丙氨酸的分析檢測方法
技術領域：
本發明屬于生物化工技術領域，涉及微流控芯片中L-苯丙氨酸分子印跡整 體柱的制備以及L-苯丙氨酸的富集、檢測。
背景技術：
L-苯丙氨酸是人體8種必需氨基酸之一，它不能由人體合成，只能通過食 物從外界攝取，但是它在人體內的含量是有限制的，如果超過一定的含量，會引發一系列相 關的疾病，如苯丙酮尿癥。苯丙酮尿癥(PKu)是一種呈世界性分布的遺傳性代謝疾病，國內發 病率大約為1 / 16500，其病因通常是由于人體內缺少苯丙氨酸羥化酶(PAH)，導致體內的苯 丙氨酸不能正常代謝為酪氨酸，引起人體血液、尿液、脊液中的苯丙氨酸的累積及酪氨酸濃 度的降低，對人腦造成破壞，導致智力低下。苯丙酮尿癥患者在幼兒時能盡早發現是可以治 療的，所以建立人體血液中苯丙氨酸濃度的測定方法是十分必要的。從1961年細菌抑制法測 定血樣中苯丙氨酸濃度篩查苯丙酮尿癥創立以來，有許多方法應用于檢測苯丙氨酸，如高效 液相色譜法、氣相-質譜法等，但是現有的方法具有樣品前處理復雜、分析速度慢、儀器昂 貴等缺點。隨著現代儀器技術發展和生物檢測技術的應用，尋求更加靈敏、方便和快速的檢 測方法成為新的目標。
分子印跡技術是一種高選擇性的特異識別方法，以其操作簡單、聚合物的選擇性好、性 能穩定、價格便宜等優點，用于固相萃取和色譜柱填料中。
整體柱(Monol池ic Column)是吸取了無孔填料和膜的快速分離能力及高效液相色譜多 孔填料的高容量，又沒有增加柱阻力等優點而發展起來的一種新型高效液相色譜填料，而分 子印跡整體柱(Molecluarly ImprintedMonol池ic Column)兼具分子印跡與整體柱的優點，具 有高效、快速、專一的特點，同時可以滿足復雜樣品前處理的要求。
此外，微流控芯片分析技術是一種新型分析技術，具有分析速度快、樣品用量少等優點。

發明內容本發明的目的是實現L-苯丙氨酸的快速富集以及檢測，提供了一種微流控
芯片中L-苯丙氨酸分子印跡整體柱的制備方法以及微流控芯片中L-苯丙氨酸的快速富集、檢 在微流控芯片的微通道中制備L-苯丙氨酸的分子印跡整體柱，并在微流控芯片中利用柱
后熒光衍生方法實現L-苯丙氨酸的快速富集與檢測，該方法包括以下步驟
(1) 將模板分子L-苯丙氨酸超聲溶解在溶劑二甲基亞砜(DMSO)中，加入功能單體、致孔 劑振蕩混合、靜置作用至少1小時以形成復合物；
(2) 向(l)中形成的復合物溶液中加入交聯劑、引發劑，超聲脫氣(時間為3 20min)， 通入氮氣除氧(時間為10 60min)，將此溶液充滿微流控芯片的微通道中，然后密封通道入 口和出口，并用0.1 2mm厚黑色的紙蓋住芯片微通道其它地方，只留下微通道中的分子印跡整體柱部分進行光照聚合反應，聚合反應在365nm左右的紫外燈光照下進行，時間為24~72 小時；這里分子印跡整體柱的長度可以通過被光照的微通道部分的長度來調節，即如果需要l cm長的分子印跡整體柱，就讓通道中lcm長的部分進行光照，而芯片其它部分用黑色紙蓋住 以不讓紫外光線通過。
(3) 將分子印跡整體柱與注射泵連接，利用溶劑沖洗柱子以除去致孔劑和模板分子，便 可得到具有良好印跡效果的分子印跡整體柱；
(4) 將分子印跡整體柱用于L-苯丙氨酸(L-Phe)的分析檢測，當樣品在注射泵的驅動下， 流經分子印跡整體柱后，與另一通道中的熒光衍生試劑4-氟-7-硝基-2，l，3-苯并氧雜惡二唑
(NBD-F)發生反應，生成具有發生熒光的物質(NBD-F與L-Phe的結合物，L-Phe-NBD)然后 流經檢測口時，利用激光誘導熒光檢測系統檢測，激光的最大激發波長為488nm。這里，樣 品中L-苯丙氨酸的含量在1 Xl(Tmol丄-1到1 Xl(Tmol丄—'之間，熒光試劑NBD-F的濃度為 1 X10—3 mol.L墨'與1 X10-5 mol.L—1之間。 其中，
(1) 所述的功能單體為4-乙稀基吡啶；致孔劑為環己醇和十二醇混合液；
(2) 所述的交聯劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯EDMA，引發劑為偶氮二異丁腈AIBN; 所述的模板分子、功能單體、交聯劑的物質的量比為1:4:15、 1:4:20、 1:4:30、 1:4:40、 1:6:15、
1:6:20、 1:6:30、 1:6:40;環己醇和十二醇的質量比分別為10:0、 9:1、 8:2、 7:3、 6:4、 5:5、 4:6、 3:7、 2:8、 1:9或0:10 。
所述的溶劑DMSO用量為環己醇和十二醇混合溶劑質量的0~1倍，最好是0.2倍、0.4 倍、0.5倍、0.8倍、l倍、1.5倍、2倍，便于稱取。溶劑和致孔劑總量為功能單體、交聯劑 總質量的1 3倍，引發劑用量為混合溶液總質量的0.2%~10% 。
所述的微流控芯片通道內徑為50 pm、 80 nm、 100 (^m、 150 |im、 200 nm，分子印跡整 體柱的長度為0.4cm 1.5 cm 。
本發明的優點在于在微流控芯片中制備了 L-苯丙氨酸分子印跡整體柱，分析速度快， 樣品用量少，分子識別性能好。


圖1為微流控芯片結構示意圖，其中，A為用于熒光衍生試劑溶液驅動的注射泵，B為 用于樣品或流動相驅動的注射泵，Cl為熒光衍生試劑溶液通道，C2為流動相通道，1為熒光 試劑溶液儲液池，2為流動相儲液池，3為廢液池，4為熒光檢測點(即在該處進行熒光采集， 熒光檢測點距離2個通道的交叉口至少1 cm)。
具體實施方式
實施例1.
首先將模板分子L-苯丙氨酸O.l mmol超聲溶解在0.20 g 二甲基亞砜中，加入致孔劑(環 己醇1.00g)，功能單體4-乙烯基吡啶0.4mmo1，相互作用1小時以形成復合物，再加入交
4聯劑EDMA4mmo1、引發劑AIBN22mg，溶液經過超聲脫氣5 min，通氮氣除氧15 min，然 后將此溶液充滿流控芯片通道中，用黑色紙蓋住不需光照的微通道部分，只留下lcm長度的 微通道，在365 nm紫外光照下聚合48小時。將制得的分子印跡整體柱與注射泵連接，分別 用甲醇、甲醇/水(80:20， v/v)溶液沖洗除去致孔劑和模板分子得到分子印跡整體柱1。 實施例2.
加入致孔劑(環己醇0.20 g和十二醇0.80 g) 實施例3.
加入致孔劑(環己醇0.40 g和十二醇0.60 g) 實施例4.
加入致孔劑(環己醇0.60 g和十二醇0.40 g) 實施例5.
首先將模板分子L-苯丙氨酸O.l mmol超聲溶解在0.20g 二甲基亞砜中，加入致孔劑(環 己醇1.00g)，功能單體4-乙烯基吡咬0.6mmo1，相互作用1小時以形成復合物，再加入交 聯劑EDMA4mmo1、引發劑AIBN22mg，溶液經過超聲脫氣5 min，通氮氣除氧15min，然 后將此溶液充滿流控芯片通道中，用黑色紙蓋住不需光照的通道部分，只留下lcm長度的通 道，在365 nm紫外光照下聚合48小時。將制得的分子印跡整體柱與注射泵連接，分別用甲 醇、甲醇/水(70: 20， v/v)溶液沖洗除去致孔劑和模板分子得到分子印跡整體柱5。
實施例6.
加入致孔齊!J(環己醇0.10 g和十二醇0.90 g)，其它同實施例5，可得到分子印跡整體柱6。 實施例7.
加入致孔劑(環己醇0.70 g和十二醇0.30 g)，其它同實施例5，可得到分子印跡整體柱7。 實施例8.
加入致孔劑(環己醇0.50 g和十二醇0.50 g)，其它同實施例5，可得到分子印跡整體柱8。 實施例9.
將分子印跡整體柱l連接到注射泵中，將10微升的2 X10—6 mol丄—1 L-苯丙氨酸溶液在 注射泵的驅動下流經分子印跡整體柱，流速2^11^1^11-1，同時利用另一臺注射泵驅動1 X10—4 mol丄—1的熒光試劑NBD-F溶液與穿過分子印跡整體柱的L-苯丙氨酸反應，到達檢測點，利 用激光誘導熒光檢測器進行檢測，通過計算流經分子印跡整體柱前后的L-苯丙氨酸質量差， 就可以得到分子印跡的富集效率，當富集后，利用洗脫液洗脫分子印跡柱，同時進行熒光檢 測，就可以檢測到洗脫下來的L-苯丙氨酸的量，從而可以進一步計算L-苯丙氨酸在整體柱上 的洗脫率。通過以上實驗，制得的分子印跡整體柱l對L-苯丙氨酸的富集效率可達到82"y。， 洗脫率達到99%。并且，從樣品富集到洗脫整個分析檢測時間只需要10分鐘。
，其它同實施例l，可得到分子印跡整體柱2。 ，其它同實施例l，可得到分子印跡整體柱3。 ，其它同實施例l，可得到分子印跡整體柱4。
權利要求
1、基于分子印跡整體柱的L-苯丙氨酸的分析檢測方法，其特征在于，在微流控芯片的微通道中制備L-苯丙氨酸的分子印跡整體柱，并在微流控芯片中實現L-苯丙氨酸的快速富集與檢測，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)將模板分子L-苯丙氨酸超聲溶解在溶劑二甲基亞砜中，加入功能單體、致孔劑振蕩混合、靜置作用1小時形成復合物；(2)向(1)中形成的復合物溶液中加入交聯劑、引發劑，超聲脫氣，時間為5min，通入氮氣除氧，時間為15min，將此溶液充滿微流控芯片的微通道中，然后密封微通道入口和出口，在365nm的紫外燈下光照聚合反應24～72小時；(3)將分子印跡整體柱與注射泵連接，利用溶劑沖洗柱子以除去致孔劑和模板分子；(4)將(3)中得到的分子印跡整體柱用于L-苯丙氨酸的分析檢測，當樣品在注射泵的驅動下，流經分子印跡整體柱后，與另一微通道中的熒光衍生試劑4-氟-7-硝基-2，1，3-苯并氧雜惡二唑發生反應，然后流經檢測口檢測。
2、 根據權利要求l所述的方法，其特征在于，模板分子、功能單體、交聯劑的物質的量 比為1:4:15、 1:4:20、 1:4:30、 1:4:40、 1:6:15、 1:6:20、 1:6:30;環己醇和十二醇的質量比分別 為10:0、 9:1、 8:2、 7:3、 6:4、 5:5、 4:6、 3:7、 2:8、 1:9或0:10 。
3、 根據權利要求l或2所述的方法，其特征在于，溶劑二甲基亞砜用量為環己醇和十二 醇混合溶劑質量的0.2倍、0.4倍、0.5倍、0.8倍、l倍、1.5倍、2倍，溶劑和致孔劑總量為 功能單體、交聯劑總質量的1 3倍，引發劑用量為混合溶液總質量的0.2%~10% 。
4、 根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，微流控芯片的微通道內徑為50pm、 80(am、 100(am、 150 nm、 200 ptm，分子印跡整體柱的長度為0.5 cm或1 cm 。
5、 根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，功能單體為4-乙稀基吡啶；致孔劑為 環己醇和十二醇混合液。
6、 根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，交聯劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯，引 發劑為偶氮二異丁腈。
全文摘要
本發明涉及在微通道中利用分子印跡整體柱進行L-苯丙氨酸的快速富集與檢測。分子印跡整體柱的制備方法將L-苯丙氨酸溶解在二甲基亞砜中，加入功能單體、致孔劑震蕩1小時后，加入交聯劑、引發劑，超聲脫氣，通氮氣除氧，將此溶液充滿微通道C2中，密封微通道，在紫外光照下反應。將分子印跡整體柱用于L-苯丙氨酸檢測時，當樣品流經分子印跡整體柱后，與另一通道C1中的熒光衍生試劑發生反應，流經檢測口檢測。
文檔編號G01N30/02GK101487822SQ200910078318
公開日2009年7月22日 申請日期2009年2月25日 優先權日2009年2月25日
發明者蘇志國, 雷建都, 馬光輝 申請人:中國科學院過程工程研究所