專利名稱：一種血清多肽及以其作為定量參比物的質譜半定量方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體地說，涉及一種血清多肽及以其作為定量參比物的質譜半定量方法。
背景技術：
質譜技術具有高分辨率、高靈敏度、高通量等特點，已經成為當前蛋白和多肽定量研究的首選技術。目前，基于質譜技術定量方法，有相對定量和絕對定量兩個大的方面。其中，相對定量主要有穩定同位素標記方法、金屬元素標記方法及基于色譜-串聯質譜的非標記定量方法等；絕對定量技術方法主要有同位素稀釋結合多反應監測質譜技術、金屬元素標記結合電感耦合等離子體質譜技術等。穩定同位素標記法克服了基于鳥槍法的定量分析中，多肽離子化效率和信號響應強度受多重因素干擾，直接用其質譜峰強度或者面積進行精確定量存在較大問題的缺陷。 將不同樣品來源的多肽分別標記“輕”質和“重”質同位素(如13C、15N和180)，由于“輕” 質和“重”質同位素標記多肽性質類似，具有相同色譜保留時間和離子化效率，此時成對出現的質譜峰信號可以準確地反映原樣品中多肽及蛋白質的比例，從而可以進行精確定量。 但是，準備同位素化合物需大量時間，并且試劑昂貴以及不同的同位素標記法適用范圍的局限性使得同位素標記定量方法的廣泛應用受到了限制。對于金屬元素標記方法的研究中，Whetstone等首次以化學性質很相近的稀土金屬元素作為質量標簽，提出了“元素編碼親和標簽”的新方法，對標記了釔和鋱元素標簽的多肽色譜行為和質譜中的裂解行為做了初步的驗證。Liu等使用二乙烯三胺五乙酸(DTPA) 雙酸酐鍵連到多肽的伯胺基，然后螯合稀土金屬離子(Y和Tb)作為質譜檢測的質量標簽，Y 和Tb標記的多肽在LC中共洗脫，其不同的離子化效率可經統計校準而獲得蛋白質的相對定量。Ahrends等系統地考察了金屬元素親和標簽(MeCAT)結合nano-LC/ESI-MSn的研究策略在蛋白質相對定量的可行性。四種不同鑭系金屬螯合物(Tb-、Ho-、Tm-和Lu-DOTA)標記的多肽在色譜中具有相同的保留時間，定量的線性動態范圍為2個數量級，最低的檢測量可達飛摩爾(10_15mol)，平均標準偏差低于15%，并用LuMeCAT和Ho-MeCAT標記不同溫度生長的酵母細胞的裂解液全蛋白樣本，結合LC-MS，發現了 56個表達差異的多肽和確定了相應的蛋白質的相對量。雖然上述研究得到了良好的結果，但是目前關于金屬元素標簽的標記方法研究尚不太多，其應用也相對較少。昂貴的同位素標記試劑、繁瑣的標記操作、受樣品來源和樣品數量的制約等標記方法的不足推動人們發展非標記的定量方法。非標定量法(Label-free)是通過比較質譜分析次數或質譜峰強度，分析不同來源樣品蛋白的數量變化。在目前廣泛使用的HPLC/MS/ MSdata-dependent分析技術中，多肽的質譜分析次數與蛋白的豐度具有相關性，包括蛋白的肽段序列覆蓋率、肽段匹配數、PMSS模型、emPAI等參數模型。但是，非標記定量技術同樣也面臨嚴峻的挑戰(1)要求LC-MS/MS分析具有良好的重現性；(2)對大量LC-MS/MS分析數據進行歸一化處理和科學的統計。目前多種數據分析軟件大大促進了非標記定量技術的應用，但非標記定量技術要達到精確和可靠的定量結果，還需進一步的完善及發展。同位素稀釋結合多反應監測質譜技術的定量方法，是目前高通量地對目標蛋白質進行絕對定量的重要方法之一。MRM-MS的基本工作原理是在第一級四極桿0)1)中選擇性檢測特定母離子，在第二級四極桿中將母離子進行碰撞解離，在第三級四極桿中選擇性檢測特定子離子。這樣，只有符合設定值的母離子-子離子信號被特異性地檢測到，有效地去除了大量干擾離子，而且M R M質譜掃描能同時監測多至300對的母-子離子對，因此MRM-MS具有靈敏度高、重現性好、準確度高和通量高等優點。將穩定同位素標記的內標肽加入到蛋白質酶切產生的內源性多肽中，由于內標肽和內源性肽具有相同的序列， 因此它們具有相同的液相色譜保留時間、質譜離子化效率和二級碎裂離子。通過比較兩者子離子信號強度，可計算出內源性多肽的量和對應蛋白質的量。但是，由于同位素試劑的昂貴，使得許多研究者不得不另辟蹊徑。近幾年，一種元素質譜技術-電感耦合等離子體質譜技術應用于蛋白質絕對定量的文獻報道不斷增加。與生物質譜不同的是，ICP-MS是一種“硬”電離模式，其工作原理簡單概括為樣品被引入氬氣流等離子體中心區，等離子體的高溫(6000 10000K)使樣品去溶劑化、汽化并離子化成正離子，各元素的正離子在真空系統內按照其質荷比分離，元素的同位素離子給出的信號與該元素在樣品中的濃度成線性關系，如果加入含有該元素的某種化合物作為內標，就可對該元素進行準確的絕對定量。與生物質譜相比，ICP-MS具有的優點是(1)線性動態范圍寬，可高達8 10個數量級；( 檢測不受樣品基質的影響，所以特別適合復雜體系中痕量或微量元素的定量。其缺點是在ICP-MS技術在定量的同時無法定性鑒定化合物的結構。ICP-MS技術應用于蛋白質組學規模化定量還存在很多亟待解決的問題，如進一步發展ICP-MS與高效的分離技術(如高效液相色譜、毛細管電泳或二維凝膠電泳)的聯用技術，發展高效的金屬標記方法，發展生物質譜技術和ICP-MS技術的聯用以實現結構的鑒定和定量的結合等。

發明內容
本發明的目的是提供一種血清多肽及以其作為定量參比物的質譜半定量方法。為了實現本發明目的，本發明的一種血清多肽，其質核比為m/z4466-4469。本發明還提供以上述血清多肽作為定量參比物的質譜半定量方法，包括以下步驟1)血清經過免疫學方法處理；向血清樣品中加入適量PBS緩沖液，然后與含有多肽抗體的固相載體混合，固相載體經乙酸洗脫后，離心取上清液；其中，所述固相載體為包被蛋白G或蛋白A的瓊脂糖顆粒；所述多肽抗體為抗多肽5抗體或抗多肽6抗體，其中多肽5和多肽6的氨基酸序列分別為NLGHGHKHERDQGHGHQ、 NLGHGHKHDRDHGHGHQ。抗多肽5抗體(或抗多肽6抗體)制備方法采用偶聯載體蛋白匙孔血藍蛋白 (KLH)的多肽5(或多肽6)作為免疫原，免疫BALB/C小鼠，然后篩選出雜交瘤細胞株，制備純化腹水單克隆抗體；或者采用偶聯載體蛋白KLH的多肽5 (或多肽6)作為免疫原，結合弗氏完全佐劑與不完全佐劑免疫大耳白兔；3-4周后耳緣靜脈采血檢測滴度，達到取血標準后頸動脈取血，分離并純化多克隆抗體。
2)采用高通量的基質輔助激光解析電離飛行時間質譜對步驟1)處理后的上清液進行檢測。3)根據質譜檢測結果計算得出標志物峰相對于參比物峰的相對強度，并將其作為反映血清中標志物含量的指標。具體地，血清經過免疫學方法處理為取15-25 μ L固相載體置于Eppendorf管中， 加入1. 5μ g-Μμ g多肽抗體，4°C混合5分鐘-4小時，放置l-5min，移出上清液，用0. OlM PH7. 4的PBS緩沖液清洗所得固相載體沉淀2-5次，每次PBS緩沖液用量為100-200 μ L ；將 10-40 μ L血清樣品和10-50 μ L上述PBS緩沖液與清洗后的所述固相載體混合，4°C旋轉混合8-Mh ；放置l-5min，移出上清液，用上述PBS緩沖液清洗沉淀2-5次，每次PBS緩沖液用量為100-200 μ L ；加入10-15 μ L5%乙酸洗脫液，吸排混合l-5min ；離心，取上清液。優選地，血清經過免疫學方法處理為取20 μ L固相載體置于0. 2mL Eppendorf管中，加入1. 5 μ g-24 μ g多肽抗體，4°C，轉速5rpm混合15分鐘，放置l-5min，移出上清液，用 0. OlM pH7. 4的PBS緩沖液清洗所得固相載體沉淀3次，每次PBS緩沖液用量為100 μ L ；將 10 μ L血清樣品和30 μ L上述PBS緩沖液與清洗后的所述固相載體混合，4°C旋轉混合他； 放置l-5min，移出上清液，用100 μ L上述PBS緩沖液清洗沉淀3次；加入10yL5%乙酸洗脫液，吸排混合anin ；離心，取上清液。進一步地，本發明的以上述血清多肽作為定量參比物的質譜半定量方法，包括以下步驟1)采用前述的免疫學方法處理血清，得上清液；幻采用高通量的基質輔助激光解析電離飛行時間質譜對步驟1)處理后的血清進行檢測，檢測次數為η ；其中，η為》1的整數；3)根據η次質譜檢測結果得到的參比物峰高&的算術平均數除以待定量標志物峰高Xm 的算術平均數，即得計算標志物的相對含量。本發明中所述的參比物并不僅僅局限于本發明中所涉及的多肽，只要是在血清中穩定存在的蛋白或多肽均可作為參比物。本發明應用血清中本身含有的物質作為參比物來對待定量的標志物進行相對定量，為世界范圍內首次提出，保證了參比物與待定量標志物來源的同一性，避免了外來參比物可能產生的干擾，操作方法簡單，較之采用常規的同位素標記法，節省了大量時間及實驗成本。本發明涉及的基于采用高通量、高靈敏度、高精確度的MALDI-T0F-MS質譜檢測方法， 不僅適用于血清中蛋白或多肽的相對定量，對于其它體液或組織中的蛋白或多肽同樣適用。


圖1為本發明經過免疫學方法處理的某肝癌病人血清的質譜圖。圖2為本發明經過免疫學方法處理的某肝硬化病人血清質譜圖。圖3為本發明經過免疫學方法處理的某正常人血清質譜圖。圖4為本發明肝癌血清組ROC曲線分析結果。圖5為本發明正常血清組ROC曲線分析結果。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，以下實施例中使用的 MALDI-T0F-MS質譜儀購自美國應用生物系統公司，型號為ABI 4700。實施例1 4中使用的血清樣品于2010年10月采集自解放軍302醫院志愿者確診病例。實施例1肝癌血清中標志物的定量1)血清經過免疫學方法處理，包括1)取20μ L固相載體，即包被蛋白G的瓊脂糖顆粒(Protein G Agarose, Santa Cruz)，置于 Eppendorf 管中，加入 IOyg 抗多肽 5 抗體，40C，5rpm旋轉混合30分鐘，放置5min，移出上清液，用0. OlM pH7. 4的PBS緩沖液清洗所得固相載體沉淀4次，每次PBS緩沖液用量為150 μ L ；取10 μ L血清樣品和30 μ L上述 PBS緩沖液與清洗后的所述固相載體混合，4°C旋轉混合12h ；放置5min，移出上清液，用上述PBS緩沖液清洗沉淀4次，每次PBS緩沖液用量為150 μ L ；加入5 μ L5%乙酸，吸排混合 5min ；離心，取上清液，用MALDI-T0F-MS檢測，測定血清樣品中的多肽標志物抗原；抗多肽5抗體的制備方法采用偶聯載體蛋白匙孔血藍蛋白(KLH)的多肽5(氨基酸序列NLGHGHKHERDQGHGHQ)作為免疫原，免疫BALB/C小鼠，然后篩選出雜交瘤細胞株，該雜交瘤細胞株為AP0105，已于2011年9月27號在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區大屯路甲3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)保藏，保藏號為CGMCC No. 5269.制備純化腹水單克隆抗體；2)質譜采集過程中，同一份血清共計采集15次，得到15張質譜圖，代表圖如圖1 所示；3)應用“Data Explore”軟件查看所得質譜圖，在相同的讀圖參數下，找出15張圖中各自所顯示的標志物的峰高Xm與參比物的峰高X,，分別為(20. 71，100)、(25. 13， 100)、(28. 08,100), (16. 55，100)、(29.82,99.15)、(19. 53，100)、(17. 22，100)、(23.35， 100)、(11. 79,98. 89)、(27. 26，100)、(25. 31,94. 55)、(21. 46,97. 32)、(17. 9，100)、(25. 32， 79. 51)、(30. 27,90. 89)；4)根據上述數據和公式N = Xm/X，計算得出標志物的相對含量為=N1 = 0. 207, N2 =0. 251，N3 = 0. 281，N4 = 0. 166，N5 = 0. 301，N6 = 0. 195，N7 = 0. 172，N8 = 0. 234，N9 = 0. 119，N10 = 0. 273，N11 = 0. 268，N12 = 0. 221，N13 = 0. 179，N14 = 0. 318，N15 = 0. 333 ；5)對上述15個值取算術平均值，得到標志物的相對含量為N = 0. 235。實施例2肝硬化血清中標志物的定量1)血清經過免疫學方法處理，包括1)取20 μ L固相載體，即包被蛋白G的瓊脂糖顆粒(Protein G Agarose, Santa Cruz)，置于 Eppendorf 管中，加入 IOyg 抗多肽 5 抗體， 40C，5rpm旋轉混合30分鐘，放置5min，移出上清液，用0. OlM pH7. 4的PBS緩沖液清洗所得固相載體沉淀3次，每次PBS緩沖液用量為100 μ L ；取10 μ L血清樣品和30 μ L上述PBS 緩沖液與清洗后的所述固相載體混合，4°C旋轉混合他；放置5min，移出上清液，用上述PBS 緩沖液清洗沉淀3次，每次PBS緩沖液用量為100 μ L ；加入5 μ L5%乙酸，吸排混合5min ； 離心，取上清液，用MALDI-T0F-MS檢測，測定血清樣品中的多肽標志物抗原；其中，抗多肽5 抗體同實施例1 ；2)質譜采集過程中，同一份血清共計采集15次，得到15張質譜圖，代表圖如圖2 所示；
3)應用“Data Explore”軟件查看所得質譜圖，在相同的讀圖參數下，找出15張圖中各自所顯示的標志物的峰高Xffl與參比物的峰高Xr,分別為(71. 98，94. 28)、(24. 68， 100)、(69. 09，100)、(46. 74，94. 1)、(46. 52，85. 68)、(42. 23，100)、(42. 78，100)、(31. 53， 96.11)、(59. 42，100)、(54.39,100)、(55. 43，100)、(39.43,92.77)、(37.31,94.61)、 (57. 78，100)、(31. 75，100)；4)根據上述數據和公式N = Xm/X，計算得出標志物的相對含量為=N1 = 0. 763, N2 =0. 247，N3 = 0. 691，N4 = 0. 497，N5 = 0. 543，N6 = 0. 422，N7 = 0. 428，N8 = 0. 328，N9 = 0. 594，N10 = 0. 544，N11 = 0. 554，N12 = 0. 425，N13 = 0. 394，N14 = 0. 578，N15 = 0. 318 ；5)對上述15個值取算術平均值，得到標志物的相對含量為N = 0. 488。實施例3正常血清中標志物的定量1)血清經過免疫學方法處理；方法同實施例2 ；2)質譜采集過程中，同一份血清共計采集15次，得到15張質譜圖，代表圖如圖3 所示；3)應用“Data Explore”軟件查看所得質譜圖，在相同的讀圖參數下，找出15張圖中各自所顯示的標志物的峰高Xm與參比物的峰高\，分別為(75. 21，71. 86)、(79. 52， 97.57)、(59.78,83.67)、(67.45,100)、(20. 99，22. 76)、(20. 55，23. 57)、(19.39,18.57)、 (21. 05,25. 99)、(74. 31,97. 42)、(96. 34，93. 16)、(85. 88，96)、(84. 4，100)、(100,97. 18)、 (54. 6,96. 19)、(18. 01,27. 36)；4)根據上述數據和公式N = Xm/X，計算得出標志物的相對含量為=N1 = 1.047, N2 =0. 815，N3 = 0. 714，N4 = 0. 675，N5 = 0. 922，N6 = 0. 872，N7 = 1. 044，N8 = 0. 810，N9 = 0. 763，N10 = 1. 034，N11 = 0. 895，N12 = 0. 844，N13 = 1. 029，N14 = 0. 568，N15 = 0. 658 ；5)對上述15個值取算術平均值，得到標志物的相對含量為N = 0. 846。實施例4肝癌血清中標志物的定量1)血清經過免疫學方法處理，包括1)取20μ L固相載體，即包被蛋白A的瓊脂糖顆粒(ProteinAAgarose, Santa Cruz)，置于 Eppendorf 管中，加入 IOyg 抗多肽 6 抗體， 40C，5rpm旋轉混合30分鐘，放置5min，移出上清液，用0. OlM pH7. 4的PBS緩沖液清洗所得固相載體沉淀3次，每次PBS緩沖液用量為100 μ L ；取10 μ L血清樣品和30 μ L上述PBS 緩沖液與清洗后的所述固相載體混合，4°C旋轉混合他；放置5min，移出上清液，用上述PBS 緩沖液清洗沉淀3次，每次PBS緩沖液用量為100 μ L ；加入5 μ L5%乙酸，吸排混合5min ； 離心，取上清液，用MALDI-T0F-MS檢測，測定血清樣品中的多肽標志物抗原；抗多肽6抗體的制備方法采用偶聯載體蛋白KLH的多肽6 (NLGHGHKHDRDHGHGHQ) 作為免疫原，結合弗氏完全佐劑與不完全佐劑免疫大耳白兔；3-4周后耳緣靜脈采血檢測滴度，達到取血標準后頸動脈取血，分離并純化多克隆抗體。2)質譜采集過程中，同一份血清共計采集15次，得到15張質譜圖。3)應用“Data Explore”軟件查看所得質譜圖，在相同的讀圖參數下，找出15張圖中各自所顯示的標志物的峰高Xm與參比物的峰高X,，分別為(23. 21，100)、(27. 49, 95.65)、(27. 34，100)、(26. 77，100)、(29. 55，100)、(19. 52，99. 15)、(20. 54，100)、(15. 88， 100)、(28. 23，100)、(13. 98,87. 79)、(28. 36，100)、(19. 46,95.52)、(14. 19，100)、(26. 22， 87. 39)、(29. 58,85. 79)。
4)根據上述數據和公式N = Xm/X，計算得出標志物的相對含量為=N1 = 0. 232, N2 =0. 287，N3 = 0. 273，N4 = 0. 268，N5 = 0. 296，N6 = 0. 197，N7 = 0. 205，N8 = 0. 159，N9 = 0. 282，N10 = 0. 159，N11 = 0. 284，N12 = 0. 204，N13 = 0. 142，N14 = 0. 300，N15 = 0. 345。5)對上述15個值取算術平均值，得到標志物的相對含量為N = 0. 2420采用實施例1 3的方法分別定量檢測70例肝癌、70例肝硬化、70例正常血清中各標志物相對含量，并進行ROC曲線分析，結果如圖4和圖5所示，肝癌血清與正常血清兩組診斷陽性標準為N <= 0. 378，分析結果為敏感度100%，特異度100% ；肝硬化血清與正常血清兩組診斷陽性標準為N < = 0. 578，分析結果為敏感度86. 7%，特異度100%。實施例1 4中使用的參比物為質核比m/z4466-4469的血清多肽，其在正常人及肝病患者血清中均存在，因此，可將其作為參比物來定量正常人與肝病患者血清中某些差異性多肽標志物的含量。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
權利要求
1.一種血清多肽，其質核比為m/z4466-4469。
2.以權利要求1所述的血清多肽作為定量參比物的質譜半定量方法，其特征在于，包括以下步驟1)血清經過免疫學方法處理；向血清樣品中加入適量PBS緩沖液，然后與含有多肽抗體的固相載體混合，固相載體經乙酸洗脫后，離心取上清液；其中，所述固相載體為包被蛋白G或蛋白A的瓊脂糖顆粒；所述多肽抗體為抗多肽 5抗體或抗多肽6抗體，其中多肽5和多肽6的氨基酸序列分別為NLGHGHKHERDQGHGHQ、 NLGHGHKHDRDHGHGHQ ；2)采用高通量的基質輔助激光解析電離飛行時間質譜對步驟1)處理后的上清液進行檢測；3)根據質譜檢測結果計算得出標志物峰相對于參比物峰的相對強度，并將其作為反映血清中標志物含量的指標；其中，作為參比物的是權利要求1所述的血清多肽。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，血清經過免疫學方法處理為取15-25μ L 固相載體置于Eppendorf管中，加入1. 5 μ g-24 μ g多肽抗體，4°C混合5分鐘-4小時，放置 l-5min，移出上清液，用0. 01MpH7. 4的PBS緩沖液清洗所得固相載體沉淀2_5次，每次PBS 緩沖液用量為100-200 μ L ；將10-40 μ L血清樣品和10-50 μ L上述PBS緩沖液與清洗后的所述固相載體混合，4°C旋轉混合8-Mh ；放置l-5min，移出上清液，用上述PBS緩沖液清洗沉淀2-5次，每次PBS緩沖液用量為100-200 μ L ；加入10-15 μ L5%乙酸洗脫液，吸排混合 l-5min ；離心，取上清液。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，血清經過免疫學方法處理為取20yL固相載體置于0. 2mL Eppendorf管中，加入1. 5μ g-Μμ g多肽抗體，4°C，轉速5rpm混合15 分鐘，放置l-5min，移出上清液，用0. OlM pH7. 4的PBS緩沖液清洗所得固相載體沉淀3次， 每次PBS緩沖液用量為100 μ L ；將10 μ L血清樣品和30 μ L上述PBS緩沖液與清洗后的所述固相載體混合，4°C旋轉混合他；放置l-5min，移出上清液，用上述PBS緩沖液清洗沉淀3 次，每次PBS緩沖液用量為100 μ L ；加入10 μ L 5%乙酸洗脫液，吸排混合^iin ；離心，取上清液。
5.根據權利要求2-4任一項所述的方法，其特征在于，包括以下步驟1)采用權利要求2-4任一項所述的免疫學方法處理血清，得上清液；2)采用高通量的基質輔助激光解析電離飛行時間質譜對步驟1)處理后的上清液進行檢測，檢測次數為η;其中，η為彡1的整數；3)根據η次質譜檢測結果得到的參比物峰高\的算術平均數除以待定量標志物峰高 Xffl的算術平均數，即得計算標志物的相對含量。
全文摘要
本發明提供了一種血清多肽及以其作為定量參比物的質譜半定量方法，該血清多肽的質核比為m/z4466-4469。本發明提供的質譜半定量技術方法包括如下步驟血清經過免疫學方法處理后，運用高通量的基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)進行檢測，在所得質譜圖中，計算得出標志物峰相對于參比物峰的相對強度，并將其作為反映血清中標志物含量的指標，由此建立完整的質譜半定量技術方法。
文檔編號C07K2/00GK102492017SQ20111035814
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月11日 優先權日2011年11月11日
發明者付海媛, 侯利平, 原劍, 周曉明, 孫云波, 張拓, 楊保安, 王東茂, 甄蓓, 肖漢族, 鄭俊杰, 魏開華, 黃亞娟 申請人:北京正旦國際科技有限責任公司, 湖南金健藥業有限責任公司