一種可口服給藥的降糖多肽及其制法和用途
【專利摘要】一種可用于口服的降血糖多肽，它是Exendin-4類似物，在Exendin-4的氨基酸序列中第12、20和27個氨基酸被非堿性氨基酸取代的降血糖多肽。本發明的降血糖多肽與Exendin-4原型相比抗酶解能力得到明顯的提高，因此可通過口服給藥，在Ⅱ型糖尿病治療中有很好的應用前景。
【專利說明】一種可口服給藥的降糖多肽及其制法和用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及可口服給藥的降糖多肽衍生物的制備及其用途，具體的說是對具有降血糖作用的活性多肽進行結構改造和修飾，使其獲得可通過胃腸道進行吸收并在體內達到有效治療濃度的特性，并將該多肽衍生物用于糖尿病的治療，屬于醫藥生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]糖尿病是一種全球范圍內的嚴重危害人類健康的常見內分泌代謝性疾病。近年來，全球糖尿病患者率以及死亡率呈現逐步上升的趨勢。糖尿病是一種與遺傳因素和多種環境因素有關的以慢性高血糖為特征的代謝紊亂綜合癥。糖尿病主要可分為兩種類型，即胰島素依賴性糖尿病(I型糖尿病)和非胰島素依賴性糖尿病(II型糖尿病)。II型糖尿病患者表現出入餐后胰島素分泌量不足，高血糖等特征。接著會產生糖尿病并發癥，如心臟病和腎功能衰退等。所以，降低血糖水平是有效治療II型糖尿病的關鍵。
[0003]人們在人體內發現的胰高血糖素類似物GLP-1對于治療II型糖尿病具有明顯的生物學作用:例如激活胰島素分泌，抑制胰高血糖素分泌，抑制胃排空和胃酸分泌等，這些均有助于降低血糖濃度。所以，GLP-1是治療二型糖尿病的很有潛力的藥物。
[0004]Exendin-4是由北美巨蜥的唾液里分離出的一種39個氨基酸的多肽。它是GLP-1的類似物，可促進葡萄糖依賴性的胰島素分泌，促進β細胞增殖，減慢胃排空，抑制食物攝取和減輕體重。并且具有二肽 酰基肽酶IV抗性，半衰期較GLP-1明顯延長。因此，Exendin-4具有很好的II型糖尿病治療藥物開發前景。但是，由于需要頻繁注射，它在臨床上的應用受到限制。從這個角度講，口服給藥的Exendin-4的開發前景非常誘人，因為這可以使病人服藥更加方便，提高治療的效果。
[0005]但是，像Exendin-4這樣的多肽的口服給藥受到自身物理化學性質的限制，比如:容易被消化酶水解，很難通過腸道被吸收等。因此，我們希望開發一種新的，既具有抗酶解特性，又具有良好腸道通透性的Exendin-4類似物。

【發明內容】

[0006]Exendin-4是一種已上市的用于治療二型糖尿病的多肽，目前其給藥方式以皮下注射為主，給患者帶來很多痛苦。可口服給藥的Exendin-4類似物的開發可以很好地解決這一問題。
[0007]本發明人在實驗中發現一種Exendin-4類似物可以通過胃腸道吸收入血，比原型的Exendin-4更適于口服藥物的開發。本發明人對這種Exendin-4類似物進行了一系列突變，減少可以被腸道中消化酶降解的氨基酸位點，篩選出了一些具有良好抗酶解特性的改構體。委托公司用固相合成法進行合成。通過一系列體內、外活性檢測，證明這些突變體可以通過口服途徑給藥，且具有明顯的降糖活性。
[0008]本發明的主要目的是設計出具有良好口服的Exendin-4的改構體。
[0009]本發明的技術方案如下:[0010]一種可用于口服的降血糖多肽，所述多肽具有序列表SQD ID NO:1所示的氨基酸序列:
[0011]His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Xaal-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Xaa2-Leu-Phe-1le-Glu-Trp-Leu-Xaa3-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys
[0012]其中，Xaal、Xaa2或 Xaa3 為所有非堿性氨基酸:Ala，Cys，Asp, Glu，Phe，Gly，lie，Ley, Met, Asn，Pro, Gin, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr 中的任一個.[0013]上述的降血糖多肽，優選的所述的多肽具有序列表SQD ID NO:2所示的氨基酸序列:
[0014]His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Xaal-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Xaa2-Leu-Phe-1le-Glu-Trp-Leu-Xaa3-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys
[0015]其中，Xaal為 Met，Ser, lie 或 Glu ；Xaa2 或 Xaa3 為 Leu，Mer,lie, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gin, Val 或 Met 中的任一個。
[0016]上述的降血糖多肽，優選的所述的多肽具有序列TSME1:His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Met-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Leu-Leu-Phe-1le-Glu-TrP-Leu-Met-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser—Cyso [0017]上述的降血糖多肽，優選的所述的多肽具有序列TSME2:His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Ser-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Gln-Leu-Phe-1le-Glu-Trp-Leu~Val-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys0
[0018]上述的降血糖多肽，優選的所述的多肽具有序列TSME3:His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Glu-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Thr-Leu-Phe-1le-Glu-TrP-Leu-Thr—Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cyso
[0019]上述的降血糖多肽，優選的所述的多肽具有序列TSME4:His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Glu-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Thr-Leu-Phe-1le-Glu-TrP-Leu-Ser-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser—Cyso
[0020]上述的降血糖多肽，優選的所述的多肽具有序列TSME5:His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Glu-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Ser-Leu-Phe-1le-Glu-Trp-Leu-Thr-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys
[0021]上述的降血糖多肽，優選的所述的多肽具有序列TSME6:His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Glu-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Ser-Leu-Phe-1le-Glu-TrP-Leu-Ser-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser—Cyso
[0022]上述的降血糖多肽，優選的所述的多肽具有序列TSME7:His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-1le-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Tyr-Leu-Phe-1le-Glu-TrP-Leu-1le-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser—Cyso
[0023]上述的任一降血糖多肽在制備口服降血糖藥物中的應用。
[0024]本發明的降血糖多肽與Exendin-4原型相比抗酶解能力得到明顯的提高，因此可通過口服給藥，在II型糖尿病治療中有很好的應用前景。【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1:TSME1_7的口服降血糖活性；
[0026]圖2:TSME1的體內生物活性，圖2A為IPGTT試驗中，腹腔注射TSME1和Exendin-4后，血糖濃度隨時間變化的曲線；圖28為IPGTT試驗中，血糖時間變化曲線的曲線下面積；
[0027]圖3:TSME1的抗胰蛋白酶酶解能力測定
[0028]圖4:TSME1治療結束前后空腹血糖的變化
[0029]圖5:TSME1治療結束后的胰島素抵抗分析
[0030]圖6:TSME1治療前后的0GTT實驗，圖6A為給藥前后的0GTT試驗中，血糖濃度隨時間的變化；圖6B為血糖時間變化曲線的曲線下面積；
[0031]圖7:TSME1治療結束后的胰臟切片(A:正常組；B:生理鹽水組；C:TSME組)
[0032]圖8:TSME1治療結束后的肝臟切片(A:正常組；B:生理鹽水組；C:TSME組)
【具體實施方式】
[0033]下面結合實施例，進一步詳述本發明。說明書及實施例中采用的儀器、化學試劑等，如未特殊說明均按常規實驗條件進行操作，或按供應商提供的說明進行操作。
[0034]本發明的TSME1-7 口服降血糖多肽是由吉爾生化(上海)公司用固相合成法進行合成,經質譜測定，
[0035]TSME1:
[0036]His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Met-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Leu-Leu-Phe-1le-Glu-Trp-Leu-Met-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys
[0037]TSME2:
[0038]His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Ser-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Gln-Leu-Phe-1le-Glu-Trp-Leu-Val-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys0
[0039]TSME3:
[0040]His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Glu-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Thr-Leu-Phe-1le-Glu-Trp-Leu-Thr-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys0
[0041]TSME4:
[0042]His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Glu-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Thr-Leu-Phe-1le-Glu-Trp-Leu-Ser-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys0
[0043]TSME5:
[0044]His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Glu-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Ser-Leu-Phe-1le-Glu-Trp-Leu-Thr-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys
[0045]TSME6:
[0046]His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Glu-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Ser-Leu-Phe-1le-Glu-Trp-Leu-Ser-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys0
[0047]TSME7:
[0048]His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-1le-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Tyr-Leu-Phe-1le-Glu-Trp-Leu-1le-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys0
[0049]實施例1
[0050]TSME1-7多肽口服降血糖活性測定:
[0051]采用腹腔注射糖耐量實驗(IPGTT)來評價TSME1-7的口服降血糖活性:
[0052]第一步:用PBS 溶液配制 lmg/mL 的 Exendin-4 溶液，和 1、0.1、0.01mg/mL 的TSME1-7 溶液。然后配制含有 25%PBS/Exendin-4/TSMEl-7 溶液、25% 丙二醇和 50%NaHC03 溶液(濃度為3%)的混合液。
[0053]第二步:選取雄性Balb/C小鼠138只，隨機分23組，每組6只。組別和給藥量如下:空白對照組(1組)(PBS溶液)；陽性對照組(1組)(Exendin-4原型分子500nmol/kg)；TSME1-7 (3 組)三劑量(5nmol/kg、50nmol/kg、500nmol/kg)。
[0054]第三步:對小鼠禁食18h。然后尾靜脈取血，并用血糖儀測定血糖濃度作為0點空白血樣。
·[0055]第四步:給各組小鼠灌胃給藥(給藥量見第二步)。
[0056]第五步:30min后腹腔注射葡萄糖溶液(2g/kg)。然后于Omin、15min、30min、45min、60min和90min時尾靜脈取血，并用血糖儀測定血糖值。結果見附圖1。
[0057]實施例2
[0058]TSME1體內生物活性檢測:
[0059]采用腹腔注射糖耐量實驗(IPGTT)來評價TSME的降血糖活性:
[0060]第一步:選取雄性Balb/C小鼠30只，隨機分5組，每組6只。組別和給藥量如下:空白對照組(1組)(PBS溶液(20mmol/L));陽性對照組(1組)(Exendin-4原型分子9nmol/kg) ；TSME1 (3 組)三劑量(3nmol/kg、9nmol/kg、27nmol/kg).[0061]第二步:對小鼠禁食18h。然后尾靜脈取血，并用血糖儀測定血糖濃度作為0點空白血樣。
[0062]第三步:給各組小鼠腹腔注射給藥(給藥量見第一步)。
[0063]第四步:給藥30min后腹腔注射葡萄糖溶液(給藥劑量同實施例1)。然后在預定的時間點(Omin、15min、30min、45min、60min和90min)尾靜脈取血，并用血糖儀測定血糖值。結果見附圖2。
[0064]實施例3
[0065]TSME1抗酶解能力測定:
[0066]第一步:用ρΗ=6.5 的 PBS 溶液配制 2mmol/L 的 trypsin 溶液。37° C 孵育 30min后使用。同時，配制200ug/mL的Exendin-4和TSME1溶液。
[0067]第二步:將20uL的Exendin-4和TSME1溶液和20uL的酶溶液混合，然后在預定的時間點(0、5、10、15、20)，用100uLl%TFA溶液終止反應。12000rpm離心5min后，上清用RP-HPLC 檢測。[0068]第三步:計算殘留率。以0點的殘留率為100%。各點的峰面積與0點峰面積的比值為各點的殘留率。結果見附圖3。
[0069]實施例4
[0070]糖尿病小鼠模型的建立
[0071]我們采用高脂飼料喂養和少量多次注射STZ誘導相結合的方式建立小鼠糖尿病模型。將Balb/C雄性小鼠隨機分為3組(一組為正常組，兩組為糖尿病組:模型組和TSME1組)，每組8只。正常組用正常飼料喂養，其他組均使用高脂飼料。
[0072]高脂飼料喂養4周之后，開始給糖尿病組小鼠注射STZ(溶于20mmol/L，pH=4.0的檸檬酸緩沖液)。采用腹腔注射的方式，連續7天，以每天一次的頻率腹腔注射STZ(40mg/kg)。穩定一周后，對小鼠禁食過夜。尾靜脈取血,并檢測血糖,空腹血糖大于11.lmmol/L的小鼠造模成功。其他小鼠從小組中剔除。
[0073]實施例5
[0074]糖尿病小鼠的治療和治療效果評價
[0075]按實施例4中所述方法建立糖尿病小鼠模型，小鼠分為3個組:正常組，模型組和TSME1組。正常組作為空白對照。TSME1組小鼠連續3周，以每天一次的頻率灌胃給TSME1(90nmol/kg,溶液配方同實施例1)。模型組灌胃給同樣體積的生理鹽水。給藥3周后，將小鼠繼續喂養，適應3天，然后開始測定口服糖耐量(0GTT)和其他指標。
[0076]在治療前后分別測定各組小鼠的空腹血糖(見圖4)和空腹胰島素含量。禁食過夜之后，對小鼠尾靜脈取血，并用血糖儀測定血糖含量。空腹胰島素用胰島素試劑盒測定。然后用Η0ΜΑ穩態模型(the homeostatic model assessment)評價胰島素抵抗水平(見圖5):H0MA-1R=空腹血糖水平(mmol/L) X空腹胰島素水平(mIU/L) /22.5。
[0077]治療前后分別對各組小鼠進行口服糖耐量(0GTT)實驗(見圖6)。具體步驟如下:
[0078]對小鼠禁食18h。然后灌胃給葡萄糖溶液(2g/kg)。并于Omin、15min、30min、45min、60min和90min時尾靜脈取血，并用血糖儀測定血糖值。
[0079]將小鼠處死后，切除胰腺和肝臟，儲存與10%的中性甲醛中。組織切片厚度為
6μ m,然后按照標準步驟用蘇木精-伊紅染色法進行染色。然后，用光學顯微鏡觀察切片(見圖7，圖8)。
【權利要求】
1.一種可用于口服的降血糖多肽，其特征是:所述的多肽具有序列表SQD ID N0:1所示的氨基酸序列:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Xaal-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Xaa2-Leu-Phe-1le-Glu-Trp-Leu-Xaa3-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys 其中，Xaal、Xaa2 或 Xaa3 為所有非堿性氨基酸:Ala，Cysj Asp，Gluj Phej Glyj He, Ley,Met, Asnj Pro, Glnj Serj Thr，Valj Trpj Tyr 中的任一個.
2.根據權利要求1所述的降血糖多肽，其特征是:所述的多肽具有序列表SQDID NO:2所示的氨基酸序列:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Xaal-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Xaa2-Leu-Phe-1le-Glu-Trp-Leu-Xaa3-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys 其中，Xaal 為 Met，Ser, Ile 或 Glu ； Xaa2 或 Xaa3 為 Leu, Mer,He, Serj Thr，Tyrj Asnj Glnj Val 或 Met 中的任一個。
3.根據權利要求2所述的降血糖多肽，其特征是:所述的多肽具有序列TSMEl=His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Met-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Leu-Leu-Phe-1le-Glu-Trp-Leu-Met-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cyso
4.根據權利要求2所述的降血糖多肽，其特征是:所述的多肽具有序列TSME2=His-GlY-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Ser-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Gln-Leu-Phe-1le-Glu-Trp-Leu~Val-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys0
5.根據權利要求2所述的降血糖多肽，其特征是:所述的多肽具有序列TSME3=His-GlY-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Glu-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Thr-Leu-Phe-1le-Glu-Trp-Leu-Thr—Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cyso
6.根據權利要求2所述的降血糖多肽，其特征是:所述的多肽具有序列TSME4=His-GlY-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Glu-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Thr-Leu-Phe-1le-Glu-Trp-Leu-Ser—Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cyso
7.根據權利要求2所述的降血糖多肽，其特征是:所述的多肽具有序列TSME5=His-GlY-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Glu-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Ser-Leu-Phe-1le-Glu-Trp-Leu-Thr-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys
8.根據權利要求2所述的降血糖多肽，其特征是:所述的多肽具有序列TSME6=His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Glu-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Ser-Leu-Phe-1le-Glu-Trp-Leu-Ser—Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cyso
9.根據權利要求2所述的降血糖多肽，其特征是:所述的多肽具有序列TSME7=His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-1Ie-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Tyr-Leu-Phe-1Ie-Glu-Trp-Leu-1le-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser—Cysο
10.權利要求1-9所述的任一降血糖多肽在制備口服降血糖藥物中的應用。
【文檔編號】A61K38/26GK103665148SQ201310694475
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月17日 優先權日:2013年12月17日
【發明者】姚文兵, 田浤, 申慶亮, 高向東 申請人:中國藥科大學