靈芝漆酶畢赤酵母基因工程菌株的構建與應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及的是一種分子生物學、基因工程領域的技術，具體是一種靈芝漆酶畢 赤酵母基因工程菌株的構建與應用。
【背景技術】
[0002] 自然界參與降解木質素的微生物種類有真菌、放線菌和細菌等，但最有效、最主 要的是真菌（BuswellJ，OdierE，KirkT.Ligninbiodegradation.CriticalReview inBiotechnology，1987,6:l_60)。主要是這些微生物能夠產生木質素修飾酶（lignin modifyingenzymes，LMEs)，主要包括木質素過氧化物酶（ligninperoxidase，LiP)(EC 1· 11. 1· 14)、猛過氧化物酶（manganeseperoxida，MnP) (EC1. 11. 1· 13)、漆酶（laccase， Lac)(EC1. 10. 3. 2)以及產生過氧化氫的氧化酶，比如乙二醛氧化酶（glyoxaloxidase， GL0X)、芳基乙醇氧化酶（Aryl-alcoholoxidase，ΑΑ0)等。
[0003] 漆酶（EC 1. 10. 3. 2)是一種含銅的多酚氧化酶，屬于藍色多銅氧化酶家族，廣泛 分布在植物、真菌、少數細菌和昆蟲中。漆酶的活性中心一般包含4個銅離子，漆酶的催 化氧化反應即通過銅離子間的協同傳遞電子，奪取反應底物的電子，將底物氧化為自由基 形式，同時將從底物捕獲的電子傳遞給〇2,將〇2還原為水（Hakulinen N，Kiiskinen LL， Kruus K，Saloheimo Μ，Paananen A, Koivula A, Rouvinen J. Crystal structure of a laccase from Melanocarpus albomyces with an intact trinuclear copper site. Nat Struct Mol Biol. 2002,9 (8): 601-605.)。漆酶作用的底物相當寬泛，典型的底物是各種 酚類化合物及其衍生物，包括簡單的二酚、多酚、甲氧基取代酚（如愈創木酚）、氨基酚、氯 酚等。在小分子的介體物質存在下，漆酶可氧化的底物范圍還將進一步擴大。由于漆酶 作用底物的廣泛性及以水作為唯一副產物，使得漆酶在綠色生物技術應用中有較好的應 用前景，主要體現在芳香族化合物合成、食品和果汁加工、土壤和水體的生物除污、紙漿漂 白等方面（Zhou Xff, Cong WR, Su KQ，Zhang YM. Ligninolytic enzymes from Ganoderma spp:current status and potential applications. Critical Review in Microbiology, 2013, 39 (4) :416-26)。在上世紀對漆酶的研究中，70年代確定了白腐菌在實驗室條件下降 解木質素的營養需求；80年代發現了白腐菌降解木質素的酶系，Lac、Lip和Μηρ ;90年代展 開了催化特征、分子生物學的研究，同時在生物制漿、生物漂白、染料廢水、制漿廢水等工業 領域的應用研究也蓬勃開展起來。
[0004] 雖然從自然界中的植物中能分離到漆酶，但是其工藝煩瑣，成本高；多種微生 物具有產生漆酶的功能，如現有文件"一種生產漆酶的方法"（201310742301. 7)中， 利用杈戴氏霉GZUIFR-H104. 1真菌菌株培養生產漆酶；"靈芝漆酶的高效清潔生產方 法"（200610096638.5)利用樹舌靈芝菌絲發酵生產漆酶等，但由于天然的產漆酶菌株的生 長緩慢，營養要求較高，或是產物在胞內形成包涵體（細菌菌株）不利于目標蛋白的純化， 漆酶產量低、生產成本高。另外，利用絲狀真菌生產漆酶還存在一些問題，如發酵周期長，培 養基要求高，酶活力低，菌絲在發酵罐中易受高剪切力的損傷等。隨著分子生物學技術的發 展，利用DNA體外重組技術構建各類工程菌株，通過工程菌株的發酵生產各種蛋白已經成 為可能，并產生了巨大的經濟效益。因此，在漆酶的生產中，克隆漆酶基因、構建漆酶基因工 程菌株，實現漆酶基因的異源表達，是今后實現重組漆酶的工業化生產及實際應用的重要 基礎。
[0005] 目前已經從多種白腐真菌中克隆了漆酶基因，如GenBank:AAR21094,AAR21096， ABP81837,AAG09229,BAA22153,AAM18407,CAA7701等。通過靈芝基因組測序發現，在靈芝 全基因組中，真菌木質素氧化酶家族中有16個漆酶基因，與其他擔子菌比較，靈芝漆酶基 因拷貝數僅次于灰蓋鬼傘菌（Coprinopsiscinerea)，提示靈芝具有很強的木質素降解能 力（陳岳文等，靈芝漆酶注釋基因Laccl的生物信息學分析及其Cu2+誘導表達，湖南農業大 學學報（自然科學版）.2013, 39 (3) : 265-269)，因此，一些研究者希望從靈芝中克隆漆酶基 因（如Genbank:AY485825 ;張銀波等，靈芝（Ganodermalucidum)漆酶基因的克隆及其序 列分析。中國生物化學與分子生物學報，2005, 21 (5) :700-704。張桂敏，王亞平，蔡立濤，馬 立新。外顯子拼接法合成真菌靈芝漆酶基因cDNA，武漢大學學報（理學版）。2007, 53(6): 701-705.)利用基因工程的方法生產漆酶，為我們的生產和生活服務。而在眾多的表達宿主 中，原核表達產量低，且有可能形成包涵體，不利于漆酶的分離純化，或有增加分離純化成 本的缺點。畢赤酵母是最近迅速發展的一種真核表達宿主，營養要求不高，適合于高密度發 酵的大規模生產方式，其分泌自身的蛋白很少，有利于表達產物的分離和純化。
[0006] 中國專利文獻號CN1657611，公開（公告）日2005. 08. 24,公開了一種具有漆酶、 木聚糖酶、過氧化物酶活性的制劑及其核苷酸序列，克隆了新的漆酶、木聚糖酶和過氧化物 酶基因，構建了漆酶、木聚糖酶和過氧化物酶基因的表達載體，將表達載體導入酵母或絲狀 真菌中表達，并檢測出重組酶的活性。將重組表達的漆酶、木聚糖酶、過氧化物酶混合酶配 制成制劑，可在造紙、環保、食品和飼料等工業中應用。但該技術并未給出用畢赤酵母作為 生產重組漆酶或木聚糖酶或過氧化物酶蛋白的宿主的具體實現方案；構建的pBARPE-Lac 表達載體僅在黑曲霉（Aspergillusniger)中得到表達，并未涉及畢赤酵母的表達。現有 研究表明：大部分絲狀真菌均有分泌漆酶的能力，該技術所測的漆酶（酶活）是菌絲體本身 分泌的漆酶還是基因工程菌產生的漆酶還很難預料，因為黑曲霉本身就是能夠分泌產生漆 酶；再之，絲狀真菌中產生漆酶的同時會分泌許多種酶類，發酵產生的混合液中的多種酶會 給后續的漆酶的分離和純化帶來眾多不便。

【發明內容】

[0007] 本發明針對現有技術存在的上述不足，提出一種靈芝漆酶畢赤酵母基因工程菌 株的構建與應用，重組畢赤酵母陽性菌株經過甲醇誘導培養，可用于制備重組靈芝漆酶 (rGILac)〇
[0008] 本發明是通過以下技術方案實現的：
[0009] 本發明涉及一種靈芝漆酶畢赤酵母基因工程菌株的構建，通過從靈芝中克隆出漆 酶基因GILac，經EcoRI和Xbal雙酶切后克隆入畢赤酵母表達質粒并構建出表達載體，最后 將其電轉化入畢赤酵母表達宿主菌中，經培養擴增和篩選后得到畢赤酵母工程菌。
[0010] 所述的靈芝，采用但不限于靈芝（G.lucidum51562)、靈芝（G.lucidum 50044)、赤芝（G.lucidum00679)、紫芝（G.sinensi50817)，優選米用靈芝（Ganoderma lucidum) 50817，均購自中國普通微生物菌種保藏管理中心（ChinaGeneral MicrobiologicalCultureCollectionCenter，CGMCC)〇
[0011] 所述的漆酶基因GILac的核苷酸序列如SeqID.No. 1所示。
[0012] 所述的雙酶切是指：將擬表達的靈芝漆酶基因GILac的cDNA序列經EcoRI和Xbal 雙酶切。
[0013] 所述的畢赤酵母表達質粒優選為經過相同的所述EcoRI和Xbal雙酶切的質粒，進 一步優選為pPICZaA。
[0014] 所述的構建是指：將擬表達的靈芝Lac的cDNA序列經EcoRI和Xbal雙酶切后，克 隆入同樣經過Xbal和EcoRI雙酶切的pPICZαA-載體，再將酶切回收產物連接、轉化大腸 桿菌DH5a感受態細胞中。
[0015] 所述的畢赤酵母表達宿主菌優選為畢赤酵母X33。
[0016] 所述的電轉化是指：取5-10μL線性化的單拷貝質粒分別加入80μL畢赤酵母 父33感受態細胞并輕輕混勻，轉入2mm預冷電轉杯，冰上放置5min，放入電轉儀，電擊，電壓： 1500V，電擊時間5. 4ms，電擊完成后，立即加入lmL、lM預冷的山梨醇，混勻后轉移到1. 5mL 離心管中，28°C，靜止1~2h，每200yL涂一塊YPD平板。28°C，培養3d，形成分散，飽滿的 單克隆，挑斑接種3mLYH)液體培養基中。
[0017] 所述的培養擴增是指：將經過電轉化的畢赤酵母X33細胞涂布于含Zeocin濃度為 1. 0mg/mL的YH)瓊脂平板30°C培養3天，然后挑取轉化子進行PCR擴增檢測。
[0018] 所述的篩選是指：篩選高拷貝重組了漆酶基因表達框架的畢赤酵母重組子作為含 漆酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌，即重組畢赤酵母陽性菌株。
[0019] 本發明涉及上述方式得到的基因工程菌株的應用，將其用于制備靈芝漆酶 rGlLac〇
[0020] 所述的制備是指：將所述重組畢赤酵母陽性菌株活化后接種于BMGY誘導前培養 基中，后轉接入1. 5LBMMY誘導培養基中，誘導表達96h;誘導后上清經透析濃縮后重溶于 tris-HCl緩沖液中，利用鎳離子親和層析（Ni-IDA)純化重組蛋白。
[0021] 所述的接種具體是指：將挑選的重組畢赤酵母X33陽性菌株接種于含有BMGY培養 液的搖瓶中，28°C下250rpm培養16-18h后，離心并收集細胞。
[0022] 所述的誘導是指：用BMMY培養液重懸接種后的細胞進行誘導，每24h補加甲醇至 終濃度為1%。
[0023] 所述的透析濃縮是指：將誘導后的產物在4000rpm、室溫環境下離心5