重組質粒pNZ8048-plnC的構建方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物工程技術領域，具體涉及一種重組質粒pNZ8048-plnC的構建 方法。
【背景技術】
[0002] 植物乳桿菌廣泛存在于人體和動物腸道內、腌制果蔬、腌制肉制品中，能利用葡萄 糖發酵代謝生產大量乳酸。除此之外，植物乳桿菌還能在胞外分泌一些具有抗菌活性的細 菌素。細菌素能被吸附在指示菌細胞膜上，引起指示菌細胞膜結構改變形成空洞，導致指示 菌胞內K+、ATP、氨基酸和磷酸鹽等物質外泄而死亡。細菌素具有熱穩定、無毒、高效和安全 等特點。
[0003] 植物乳桿菌ZJ316是從健康嬰兒糞便中分離篩選得到的一株植物乳桿菌，對該菌 的上清發酵液過膜除菌，經排酸、過氧化物以及胰蛋白酶和蛋白酶K等酶處理之后進行抑 菌試驗，試驗結果表明經過一系列處理后的發酵上清仍然對指示菌具有較強的抑菌效果， 并經過全基因組測序，確認植物乳桿菌ZJ316在發酵過程中產細菌素。相比較乳酸鏈球菌 所產的Nisin細菌素對革蘭氏陽性菌呈廣譜抑菌而言，植物乳桿菌ZJ316所產的細菌素對 大腸桿菌、銅綠假單胞菌、沙門氏菌、李斯特、藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌、檸檬色葡萄球 菌和副溶血性弧菌等革蘭氏陰性和陽性致病菌具有明顯的抗菌作用，具有抗菌廣譜性。綜 上所述，植物乳桿菌ZJ316細菌素在食品、工業、農業和醫藥等領域具有較大的開發價值。
[0004] 植物乳桿菌ZJ316細菌素合成基因簇的5個啟動子序列非常相似，具有高度保守 的-35和-10區（5' -TACGTTAAT-3'），-35區和-10區之間間隔著12bp的距離，研究表明 這兩個區域的間隔長度對轉錄效果具有很大的影響。通過對植物乳桿菌細菌素生物合成的 群體感應調節操縱子plnABCD分析，植物乳桿菌ZJ316存在群體感應調控的信號肽基因基 因plnc8IF和組氨酸蛋白激膜蛋白酶基因plnB，但是胞內缺乏調控蛋白基因plnC和plnD， 因此，我們猜測三種可能性：一是植物乳桿菌ZJ316胞內缺乏調控蛋白，群體感應信號通路 中斷；二是除文獻已報道的調控蛋白基因PlnC和plnD外，還存在類似調控功能的未知蛋白 PlnX ;三是植物乳桿菌ZJ316還存在另外一套細菌素生物合成群體感應調節機制。
[0005] 本課題針對第一種猜測，通過將克隆有調控基因的重組質粒轉化至植物乳桿菌 ZJ316胞內，利用載體質粒上的信號肽強轉錄啟動子Pnc8IF表達調控蛋白以彌補群體感應 調控蛋白的缺失，搭建完善群體感應調節通路，研究和探討調控蛋白PlnC和PlnD在植物乳 桿菌ZJ316細菌素代謝合成作用調節機制。通過調控蛋白在植物乳桿菌ZJ316胞內表達可 以為植物乳桿菌ZJ316細菌素群體感應模式研究提供理論依據；為群體感應系統的開發奠 定基礎；為植物乳桿菌ZJ316細菌素高產研究提供一種創新思路，在植物乳桿菌ZJ316細菌 素的開發和商業運用上也具有十分重要的意義。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于提供一種重組質粒pNZ8048_plnC的構建方法，以便更好的研 究調控蛋白PlnC對植物乳桿菌細菌素的生物代謝的調控機制。
[0007] 為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：
[0008] 重組質粒pNZ8048_plnC的構建方法，以植物乳桿菌ZJQ (分類命名：植物乳桿菌， 拉丁文學名Lactobacillus plantarum，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心，保藏單位簡稱CGMCC，保藏單位地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日 期：2013年03月29日，保藏編號7391。）基因組為模板，PCR擴增plnC目的基因，將擴增 得到的基因片段用PCR產物純化試劑盒純化特異性擴增條帶，將純化后的PCR產物和質粒 PNZ8048經Ncol和Hind III雙酶切后純化，16°C連接過夜，得到重組質粒pNZ8048-plnC。
[0009] 所述PCR擴增所用引物為：
[0010]上游引物：5,-CATGCCATGGCTGTGTTTCCAATTTATTTATTAGA-3'
[0011]下游引物：5' -CCCAAGCTTCTATTTCTTTTTCAATATTTTGT-3'。
[0012] 所述 PCR 擴增反應體系為：10Xbuffer(Mg2+)2 yL，2. 5mmol/L dNTP Mixturel. 6 μ L，10 μ mol/L 上游引物 0· 8 μ L，10 μ mol/L 下游引物 0· 8 μ L，DNA 模板 1 μ L， rTaq DNA PolymeraseO. 2 μ L，其余為滅菌超純水，總體積為20 μ L ;所述PCR擴增反應條件 為：95°(：預變性511^11;進入循環，95°(：變性3〇8,49°(：退火5〇8,72°(：延伸5〇8,31個循環 ；反 應結束后72°C延伸10min，降溫至4°C保存。
[0013] PCR 產物的雙酶切反應體系為：10XK Buffer4yL，plnCPCR 產物 30yL，Nco I 2 μ L，Hind III 2 μ L，ddH20 2 μ L，總體積為 40 μ L ;pNZ8048 的雙酶切反應體系為：10XK Buffer4yL，pNZ8048 質粒 30yL，Nco I 2yL，Hind III 2yL，ddH20 2 yL，總體積為 40 μ L〇
[0014] ?111(：酶切目的片段6 4 1^，酶切質粒口似80482 41^，10\丁40嫩1^838681^€61141^， T4DNAligasel μ L，總體積 10 μ L。
[0015] 植物乳桿菌存在群體感應效應，其中plnAB⑶是群體感應調控操縱子，pin⑶編 碼調控蛋白PlnC和PlnD。有報道表明，PlnC可能起促進轉錄作用，PlnD可能起抑制轉錄 作用，但目前關于兩者究竟如何調節轉錄及其作用機制尚不明確。本發明構建的重組質粒 pNZ8048-PlnC，能在植物乳桿菌ZJ316(缺乏調控蛋白PlnC和PlnD)中表達。該體系有助于 研究和探討PlnC在植物乳桿菌ZJ316中的轉錄調節機制，進而有助于揭示PlnC對植物乳 桿菌ZJ316細菌素合成代謝調節機制，為植物乳桿菌ZJ316群體感應模式研究提供理論依 據，也為植物乳桿菌ZJ316細菌素高產研究提供一種創新思路，在植物乳桿菌ZJ316細菌素 的開發和商業運用上也具有十分重要的意義。同時，該體系也適用于研究PlnC對除ZJ316 外的其他植物乳桿菌細菌素合成調節機制，為植物乳桿菌群體感應系統的開發奠定基礎。
[0016] 本發明中涉及的植物乳桿菌ZJQ已于2013年03月29日在中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中心進行保藏，分類命名：植物乳桿菌，拉丁文學名Lactobacillus plantarum，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位簡稱 CGMCC，保藏單位地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期：2013年03月29日， 保藏編號7391。
【附圖說明】
[0017] 圖1植物乳桿菌ZJ9基因組；注：M :Marker，上樣量3 μ L l-Ly植物乳桿菌ZJ9 基因組，上樣量5 μ L。
[0018] 圖2 PCR擴增plnC目的基因；注：M :Marker，上樣量3 μ L ;L「L9:植物乳桿菌ZJ9 號plnC基因PCR基因電泳條帶，上樣量3 μ L 1。:不加DNA模板的陰性對照，上樣量3 μ L。
[0019] 圖3 PCR擴增plnD目的基因；注：M :Marker，上樣量3 μ L A-Lg:植物乳桿菌9號 plnD基因PCR基因電泳條帶，L「LS，上樣量3 μ L，L9:上樣量5 μ L ;Li。:不加DNA模板的陰 性對照，上樣量5 μ L。
[0020] 圖4 ρΝΖ8048質粒粘性末端片段的獲取；注：M :Marker，上樣量3 μ L ;L1:Nco I和 HindIII雙酶切后的DNA片段，上樣量5μL;L2:NCOI單酶切后的片段，上樣量5μL;L 3: Hind III單酶切后的片段，上樣量5 μ L ;L5:pNZ8048環狀質粒，上樣量5 μ L。
[0021] 圖5目的基因片段粘性末端片段的獲取；注：M :Marker，上樣量3 yL ;L1:Nc〇 I和 把11(1111雙酶切后的？111(：片段，上樣量5 41^山2:叱〇1和出11(1111雙酶切后的？111〇片 段，上樣量3 μ L。
[0022] 圖6重組質粒pNZ8048-plnC圖譜；將酶切后的pNZ8048質粒和plnCPCR片段進行 連接，后轉化大腸桿菌，并將其涂布在含有30 μ g/mL氯霉素的LB固體培養基上，37°C培養 箱中培養16-18小時；圖