用于測定神經毒素多肽的生物學活性的細胞測試系統的制作方法
【專利說明】用于測定神經毒素多肽的生物學活性的細胞測試系統
[0001] 本發明涉及用于生成神經毒素敏感的、神經元分化的細胞的方法，所述方法包括 步驟為：a)在引發所述腫瘤細胞神經元分化的條件和時間下，在培養基中培養能夠分化為 神經元細胞的腫瘤細胞；和b)在具有100至270m0sm/kg的重量摩爾滲透壓濃度，并且包 含（i)B27補充物和/或（ii)N2補充物的分化培養基中培養a)的經引發神經元分化的腫 瘤細胞至少3天，從而獲得神經毒素敏感的、神經元分化的細胞。本發明還涉及通過本發 明的方法可獲得的神經毒素敏感的、神經元分化的細胞。此外，本發明涵蓋用于測定神經 毒素多肽的活性的方法，所述方法包括步驟為：a)將通過本發明的方法可獲得的神經毒素 敏感的、神經元分化的細胞與神經毒素多肽相接觸；b)在允許神經毒素多肽發揮其生物學 活性的條件下培養步驟a)的神經毒素敏感的、神經元分化的細胞3至74小時或72小時； 和c)在根據步驟b)培養后，測定所述細胞中神經毒素多肽的活性。最后，本發明提供包含 OptiMEM、FBS、B27補充物、和N2補充物的培養基。
[0002] 肉毒梭菌（Clostridium botulinum)和破傷風梭菌（Clostridium tetani)生產 強力的神經毒素，即分別是肉毒梭菌毒素（BoNT)和破傷風毒素（TeNT)。這些梭菌神經毒 素（CNT)特異性結合神經元細胞并且破壞神經遞質釋放。每種毒素都作為無活性的未加工 的約150kDa的單鏈蛋白質合成。翻譯后加工涉及二硫橋的形成，和細菌蛋白酶的有限的 蛋白水解作用（切割）。活性神經毒素由兩條鏈組成，約50kDa的N端輕鏈和約IOOkDa的 重鏈，兩鏈通過二硫鍵連接。CNT結構上和功能上由3個結構域組成，即，催化輕鏈、涵蓋了 易位結構域（N端一半）和受體結合結構域（C端一半）的重鏈；參見，例如，Krieglstein 1990,Eur J Biochem 188, 39 ；Krieglstein 1991,Eur J Biochem 202,41 ；Krieglstein 1994, J Protein Chem 13, 49。肉毒梭菌神經毒素是作為分子復合物合成的，所述復合物包 含150kDa神經毒素蛋白和相關聯的無毒蛋白。復合物大小基于梭菌菌株和范圍從300kDa， 至500kDa以上，和900kDa的不同神經毒素血清型而不同。這些復合物中的無毒蛋白使神 經毒素穩定，并保護其免受降解；參見Silberstein 2004, Pain Practice 4, S19-S26。
[0003] 肉毒梭菌分泌命名為肉毒梭菌神經毒素（BoNT)的A至G的7種抗原性不同的 血清型。所有的血清型與由破傷風梭菌分泌的相關破傷風神經毒素（TeNT)都是Zn 2+-內 切蛋白酶，其通過切割SNARE蛋白阻斷突觸的胞外分泌；參見Couesnon，2006, Mi crob i ology，152, 759。CNT導致在肉毒中毒和破傷風中所見的弛緩性肌肉麻痹；參見Fischer 2007, PNAS 104,10447。
[0004] 不論其毒性效應，肉毒梭菌毒素復合物已在多種疾病中被用作治療劑。肉毒梭菌 毒素 A血清型于1989年在美國被批準用于人用途，用于治療斜視、瞼痙攣和其他病癥。它 作為肉毒梭菌毒素 A(BoNT/A)蛋白制備物是可商購的，例如商標名BOTOX (Allergan Inc) 或商標名DYSP0RT/REL0XIN(IpSen Ltd)。改良的、不含復合物的肉毒梭菌毒素 A制備物是 可商購的，商標名為XE0MIN(Merz Pharmaceuticals GmbH)。出于治療應用，將制備物直接 注射入待治療的肌肉中。在生理PH下，毒素從蛋白質復合物中釋放并且產生所需的藥理學 作用。肉毒梭菌毒素的效應只是暫時的，這是為何維持治療效果需要重復施用肉毒梭菌毒 素的原因。
[0005] 梭菌神經毒素弱化主動肌肉強度并且是斜視、局限性肌張力障礙（包括頸肌張力 障礙和良性自發性瞼痙攣）的有效療法。其還表現出緩解偏側面肌痙攣和局部痙攣，并且 對廣泛的其他適應證有效，例如胃腸道病癥、多汗癥和美容皺紋校正；見Jost 2007, Drugs 67, 669。
[0006] 在生產梭菌神經毒素的過程中，所述神經毒素的定性和定量測定以及生物學活性 的神經毒素多肽的質量控制是特別重要的。此外，政府機構僅接受簡單、可靠和經驗證的肉 毒梭菌毒素活性測定法。目前，小鼠 LD5tl生物測定法，一種致死性測試，依然是藥物生產商 用于分析其制備物的效能的"金標準";見Arnon等人（2001) ,JAMA 285,1059-1070。然而， 在近些年，已經進行了相當多的努力以尋找備選的方法以減輕對動物測試的需要和與此類 型的基于動物的測定法相關的全部缺點、成本和倫理學顧慮。此外，管理機構要求制藥公司 對肉毒梭菌神經毒素的效能測試應用3 "R"原則："降低（Reduce)，精煉（Refine)，替代 (Replace) ";見 Straughan, Altern. Lab. Anim. (2006)，34, 305-313。因此，已經開發了基于 細胞的測試系統以提供使用活動物的方法的合理的備選方法。然而，迄今僅有3個已顯示 對神經毒素多肽足夠敏感的細胞測試系統對于測定神經毒素生物學活性是可用的。這些基 于細胞的測試系統包括使用從嚙齒類動物胚胎分離的在體外分化的原代神經元（Pellett 等人（2011)，Biochem. Biophys. Res. Commun. 404, 388-392)，神經元分化的誘導的多能干 細胞（Whitemarsh 等人（2012) ,Toxicol. Sci. 126, 426-35)，和 SiMa 細胞系的亞克隆（W0 2010/105234A1)。
[0007] 然而，分離原代神經元需要殺死動物并且是費力費時的。此外，使用不同原代神經 元的測試系統顯示了大的變異性。類似地，生成神經元分化的誘導的多能干細胞是困難的 并且費時的。此外，此類細胞的貯藏是非常麻煩的。使用腫瘤細胞系的測定法通常對BoNT 不夠敏感。并且，所述腫瘤細胞系需要復雜的分化方案，這導致使用所述細胞系的測定法的 大的變異性和/或高失敗率。
[0008] 有鑒于上述，可被政府機構接受并且提供基于動物的測試系統的備選方法的用于 測定神經毒素多肽活性的其他測試系統是高度渴求的。
[0009] 因此，本發明的技術問題可以看作為提供符合前述需求的工具和方法。此技術問 題由在權利要求書和下文中所表征的實施方式解決。
[0010] 在第一個方面，本發明涉及生成神經毒素敏感的、神經元分化的細胞的方法，所述 方法包括步驟為：
[0011] a)在引發所述腫瘤細胞神經元分化的條件和時間下，在培養基中培養能夠分化為 神經元細胞的腫瘤細胞；和
[0012] b)在具有100至270m0sm/kg的重量摩爾滲透壓濃度，并且包含（i)B27補充物和 /或（ii) N2補充物的分化培養基中培養a)的經引發神經元分化的腫瘤細胞至少3天，從而 獲得神經毒素敏感的、神經元分化的細胞。
[0013] 在本發明的方法中，在引發所述腫瘤細胞神經元分化的條件和時間下，首先在細 胞培養基中生長能夠分化成神經元細胞的腫瘤細胞。之后，將如此經引發神經元分化的腫 瘤細胞轉移至具有100至270m0sm/kg的重量摩爾滲透壓濃度的分化培養基中。此外，此分 化培養基至少包含（i)B27補充物和/或（ii)N2補充物。備選地，分化培養基可以包含NS21 補充物，代替B27補充物和/或N2補充物。在所述分化培養基中的培養進行至少3天。從 而獲得神經毒素敏感的、神經元分化的細胞。優選地，分化培養基包含neurobasal培養基。 [0014] 本發明的此新型分化方法或方案的結果是獲得神經毒素敏感的、神經元分化的細 胞，其表現出顯著改善的對神經毒素多肽的敏感性，如以下實施例中詳細所示。
[0015] 梭茵神經毒素的特征在于其特異性地抑制神經遞質從突觸前神經末梢分泌。對周 圍神經元的選擇性是通過兩個不同受體SV2和GTlb的識別來介導的。神經毒素的生理學 作用基于受體結合和神經毒素的輕鏈易位后的所謂的SNARE復合物的蛋白質的切割。BoNT 生物學活性的測定是所述神經毒素蛋白的表征中重要的方面并且尤其為管理機構所要求 用于含有BoNT的產品的許可。因此，用于BoNT的生物學活性的測量的可靠的測試是研宄、 開發和銷售含有BoNT的產品的基礎。此外，出于倫理學原因，基于細胞的測試系統應當代 替迄今主要的動物測試。為了建立此類基于細胞的測試系統，對于肉毒梭菌神經毒素有足 夠高敏感性的神經元細胞或細胞系是必要的。然而，為了獲得此類高敏感性，迄今需要費力 的神經元細胞系的分化方法。結果是僅幾個基于細胞的測試系統是可用的。為了測定藥 物產品中肉毒梭菌毒素的生物學活性，神經元細胞或細胞系應當具有以下性質：首先，細胞 應當是人、神經元來源的以與靶，即人類患者盡可能相似。其次，細胞系統應當對終產品中 的賦形劑是強健的并且優選地，對生產過程的中間步驟中的雜質也是強健的（過程控制）。 第三，基于細胞的測試系統應當表現出動態的測量范圍，其允許準確測定小管中BoNT (例 如，50U BoNT/A)的生物學活性。考慮到技術因素諸如賦形劑的溶解性，細胞培養基的體積 等，必須準確地測量低于IpM的BoNT濃度。根據本發明人最大所知，迄今僅有三個基于細 胞的測試系統是可用的，其顯示對BoNT的足夠高的敏感性。這些包括來自嚙齒類動物的胚 胎的原代神經元、神經元分化的誘導的多能干細胞和SiMa細胞系的亞克隆，如本文別處已 經提及的。然而，已報道所述細胞系僅在頻繁與大的變異性相關聯的復雜的并且費力的分 化方案后才表現出足夠高的敏感性。相比之下，本發明提供了用于測量肉毒梭菌神經毒素 (BoNT)的生物學活性的簡單、可靠并且強健的基于細胞的測試系統，其滿足了上述要求并 且較之本領域中描述的細胞測試系統進一步改善。
[0016] 更具體而言，首先如本領域所述培養SiMa(人神經母細胞瘤）和P19(鼠胚胎性 癌）腫瘤細胞，然后在多孔板上接種并引發神經元分化，如本文別處和以下實施例所述。在 隨后的、新的分化步驟中，用包含具有低重量摩爾滲透壓濃度，諸如100至270m0sm/kg的重 量摩爾滲透壓濃度的培養基的分化培養基替換細胞培養基。此類具有低重量摩爾滲透壓濃 度的培養基的一個實例是neurobasal培養基。在分化一段時間后（例如，3至7天）（在 這段時間中用新鮮培養基替代培養基），如果適用，將神經毒素多肽添加至細胞培養基。此 外，在本發明的方法中使用GTlb作為對BoNT的敏感性增強劑。例如，在用神經毒素多肽使 細胞中毒時和/或之前，將50 μ M GTlb添加至neurobasal培養基。在用神經毒素多肽再 孵育72h后，終止細胞并分析神經毒素多肽的生物學活性。結果是，發現了所述細胞對BoNT 的敏感性顯著增加。
[0017] 本發明人已經令人吃驚地發現，分化培養基的低重量摩爾滲透壓濃度是由本發明 的方法生產的神經毒素敏感的、神經元分化的細胞對BoNT的增加的敏感性的原因，如以下 實施例所證明。此發現并非微不足道的任務，如最終以本發明的方法結束的實驗歷史所證 明的：開始時，發明人使用本領域中描述的分化培養基，其包含MEM+N2補充物+B27補充物； 見分化培養基2,實施例中。能夠由此分化培養基實