一種利用血紅蛋白提高發酵細胞密度的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，涉及一種利用血紅蛋白提高發酵細胞密度的方法。
【背景技術】
[0002] 高密度發酵技術一直是工業生產中要求的高效技術。對于很多需氧微生物，在發 酵過程中限制細胞密度的最為重要的因素是氧氣的利用。因此需要開發出了多種針對提高 需氧微生物氧氣利用率的技術。
[0003]目前已知的提高細胞密度的方法主要分為兩類，其中一類是改變微生物的發酵條 件來提高氧氣的利用。例如在發酵過程中增大發酵罐中的通氣量，增大發酵罐的壓力，增大 發酵罐攪拌槳轉速，降低發酵罐中培養溫度，提高輸入空氣中的氧氣含量等方法。另外一類 是利用微生物菌種改造，發明多種能夠高效利用氧氣的基因工程重組菌株。
[0004] 現有的重組菌株大多是利用表達血紅蛋白來吸收更多的氧氣供給微生物本身使 用。血紅蛋白是一種氧結合蛋白，廣泛存在于動植物和微生物中。血紅蛋白的表達能夠促 進細菌的生長。然而目前的重組菌株大多利用血紅蛋白的過表達，天然的低氧啟動子啟動 等。由于血紅蛋白在細胞質里面，細胞外膜、細胞壁和細胞膜把血紅蛋白和氧氣充分隔開， 限制了血紅蛋白與氧氣的接觸，氧氣利用效率因此下降，不利于細胞的高密度生長。

【發明內容】

[0005] 本發明的一個目的是提供一種提高微生物發酵細胞密度的方法。
[0006] 本發明提供的方法，為通過如下1)_4)中至少一種方法構建重組微生物，促進重 組微生物中的血紅蛋白分子與氧氣的接觸，提高氧氣的利用率，實現提高微生物發酵細胞 密度：
[0007] 1)在微生物細胞周質空間表達血紅蛋白；使得氧氣在周質空間內即可和血紅蛋 白發生結合，減少氧氣進入細胞過程中的損失，提高利用率，從而提高細胞的生長數量和密 度；
[0008] 2)利用細胞表面展示將血紅蛋白呈遞微生物細胞外膜表面；使得血紅蛋白在外 膜直接與氧氣發生結合，減少氧氣在傳入細胞內部過程的損失；
[0009] 3)去除或重塑微生物細胞外膜；使表達在胞內或細胞周質空間的血紅蛋白吸收 更多的氧氣，供給更多細胞生長繁殖，從而提高細胞的生長數量和密度；
[0010] 4)在微生物細胞內過表達血紅蛋白；血紅蛋白可以吸收更多的細胞周圍的氧氣 分子進入細胞內部，供給細胞生長繁殖所使用，從而提高細胞的生長數量和密度。
[0011] 上述方法中，
[0012] 所述提高微生物發酵細胞密度的方法為如下1) _4)中任一種：
[0013]1)在微生物細胞周質空間表達血紅蛋白，
[0014] 2)在微生物細胞周質空間表達血紅蛋白，且利用細胞表面展示將血紅蛋白呈遞所 述微生物細胞外膜表面；
[0015] 3)在微生物細胞周質空間表達血紅蛋白，且去除或重塑所述微生物細胞外膜；
[0016] 4)在微生物細胞內過表達血紅蛋白。
[0017] 上述方法中，
[0018] 所述在微生物細胞周質空間表達血紅蛋白為利用雙精氨酸轉運系統將血紅蛋白 定位到微生物細胞周質空間表達；
[0019] 所述細胞表面展示為膜蛋白展示技術，所述膜蛋白展示技術包括但不限于冰晶核 蛋白、自體轉運蛋白和S層蛋白，所述膜蛋白展示技術包括冰晶核蛋白、自體轉運蛋白和S 層蛋白中至少一種；
[0020] 所述去除或重塑微生物細胞外膜為敲除或抑制細胞外膜的合成基因的表達，所述 細胞外膜的合成基因包括LpxA、LpxC、LptDl、LptD2、LpxH、LpxB、LpxK、LpxL和LpxF中至少 一種，所述細胞外膜的合成基因包括但不限于LpxA、LpxC、LptDl、LptD2、LpxH、LpxB、LpxK、 LpxL 和 LpxF〇
[0021] 上述提高微生物發酵細胞密度的方法為如下A)或B)或C)或D):
[0022] A)所示的方法包括如下步驟：將tat信號肽編碼基因、驅動血紅蛋白表達的啟動 子、血紅蛋白編碼基因導入出發微生物細胞中，得到重組微生物，發酵所述重組微生物，使 血紅蛋白通過tat信號肽定位到所述重組微生物細胞周質空間表達，實現提高微生物發酵 細胞密度；
[0023] B)所示的方法包括如下步驟：將tat信號肽編碼基因、驅動血紅蛋白表達的啟動 子、血紅蛋白編碼基因和轉運蛋白編碼基因導入出發微生物細胞中，得到重組微生物，發酵 所述重組微生物，使血紅蛋白通過轉運蛋白和tat信號肽展示到所述重組微生物細胞膜外 并在細胞周質空間表達，實現提高微生物發酵細胞密度；
[0024] C)所示的方法包括如下步驟：敲除出發微生物基因組中的LpxA和LptD基因，且 將tat信號肽編碼基因、驅動血紅蛋白表達的啟動子和血紅蛋白編碼基因導入所述出發微 生物中，得到重組微生物，發酵所述重組微生物，促進所述重組微生物細胞內或細胞間質的 血紅蛋白吸收氧分子，實現提高微生物發酵細胞密度；
[0025] D)所示的方法包括如下步驟：將驅動血紅蛋白表達的啟動子、血紅蛋白編碼基因 導入出發微生物細胞中，得到重組微生物，發酵所述重組微生物，使血紅蛋白在所述重組微 生物細胞內過表達，實現提高微生物發酵細胞密度。
[0026] 上述方法中，
[0027] 所述出發微生物為革蘭氏陽性或陰性細菌，但不限于大腸桿菌、嗜鹽菌、假單胞菌 或芽孢桿菌；
[0028] 所述出發微生物包括大腸桿菌、嗜鹽菌、假單胞菌或芽孢桿菌；
[0029] 所述提高微生物發酵細胞密度為所述重組微生物發酵后的細胞干重大于所述出 發微生物發酵后的細胞干重。
[0030] 上述方法中，
[0031] A)所示的方法中，所述tat信號肽編碼基因、所述驅動血紅蛋白表達的啟動子和 所述血紅蛋白編碼基因通過重組載體導入所述出發微生物；
[0032] B)所示的方法中，所述tat信號肽編碼基因、所述驅動血紅蛋白表達的啟動子、所 述血紅蛋白編碼基因和所述轉運蛋白編碼基因通過重組載體導入所述出發微生物；
[0033] C)所示的方法包括如下步驟：敲除出發微生物基因組中的LpxA和LptD基因，得 到中間出發菌，再將所述tat信號肽編碼基因、所述驅動血紅蛋白表達的啟動子和所述血 紅蛋白編碼基因通過重組載體導入所述中間出發菌中，得到重組微生物；
[0034] 所述敲除出發微生物基因組中的LpxA的方法為向所述出發微生物導入LpxA同源 重組片段；所述LpxA同源重組片段由LpxA上游同源臂、標記基因和LpxA下游同源臂組成；
[0035] 所述敲除微生物細胞基因組中的LptD為向所述出發微生物導入LptD同源重組片 段；所述同源重組片段LptD由LptD上游同源臂、標記基因和LptD下游同源臂組成；
[0036] D)所示的方法中，
[0037] 所述驅動血紅蛋白表達的啟動子和所述血紅蛋白編碼基因通過重組載體導入所 述出發微生物。
[0038] 上述方法中，
[0039] 所述tat信號肽的氨基酸序列為序列表中序列18 ;
[0040] 所述驅動血紅蛋白表達的啟動子為porin啟動子；所述porin啟動子的核苷酸序 列為序列表中序列1第33-250位；
[0041] 所述血紅蛋白的氨基酸序列為序列表中序列19 ;
[0042] 所述轉運蛋白為Antigen43 β;所述轉運蛋白Antigen43 β的氨基酸序列為序列 表中序列20;
[0043] 所述LpxA上游同源臂的核苷酸序列為序列8第1-40位核苷酸；
[0044] 所述LpxA下游同源臂的核苷酸序列為序列8第1364-1403位核苷酸；
[0045] 所述LpxA同源重組片段的核苷酸序列具體為序列8 ;
[0046] 所述LptD上游同源臂的核苷酸序列為序列9第1-40位核苷酸；
[0047] 所述LptD下游同源臂的核苷酸序列為序列9第1364-1403位核苷酸；
[0048] 所述LptD同源重組片段的核苷酸序列具體為序列9 ;
[0049] A和C所示的方法中的所述重組載體的核苷酸序列為序列2 ;
[0050]B所示的方法中的所述重組載體的核苷酸序列為序列7 ;
[0051]D所示的方法中的所述重組載體的核苷酸序列為序列1 ;
[0052] 所述tat信號肽編碼基因的核苷酸序列為序列2的第277-384位核苷酸；
[0053] 所述血紅蛋白編碼基因的核苷酸序列為序列1第277-717位；
[0054] 所述轉運蛋白Antigen43 β編碼基因的核苷酸序列為序列7第820-2799位。
[0055] 上述方法在提高微生物細胞生產的化合物產量中的應用也是本發明保護的范 圍；
[0056] 所述化合物為大分子化合物、小分子化合物或者蛋白，所述小分子化合物具體為 ALA，所述蛋白具體為phaP;所述大分子化合物具體為ΡΗΒ;
[0057] 或上述方法中的重組微生物也是本發明保護的范圍。
[0058] 本發明的另一個目的是提供一種提高微生物細胞生產化合物產量的方法。
[0059] 本發明提供的方法，利用上述方法構建重組微生物細胞的同時，向所述出發微生 物導入合成化合物基因，得到重組微生物，發酵所述重組微生物，實現提高微生物細胞生產 化合物產量。
[0060] 上述方法中，所述化合物為大分子化合物、小分子化合物或者蛋白，所述小分子化 合物具體為ALA，所述蛋白具體為phaP ;所述大分子化合物具體為PHB ;
[0061] 所述提高微生物細胞生產化合物產量為所述重組微生物發酵生產化合物產量大 于所述表達合成化合物基因的微生物生產化合物產量；
[0062] 所述表達合成化合物基因的微生物為將所述合成化合物基因導入所述出發微生 物中得到的重組微生物。
[0063] 上述方法為如下a)或b)或c)或d):
[0064] a)所示的方法包括如下步驟：將tat信號肽編碼基因、驅動血紅蛋白表達的啟動 子、血紅蛋白編碼基因和合成化合物基因導入出發微生物細胞中，得到重組微生物，發酵所 述重組微生物，實現提高微生物細胞生產化合物產量；b)所示的方法包括如下步驟：將tat 信號肽編碼基因、驅動血紅蛋白表達的啟動子、血紅蛋白編碼基因、轉運蛋白編碼基因和合 成化合物基因導入出發微生物細胞中，得到重組微生物，發酵所述重組微生物，實現提高微 生物發酵細胞密度；
[0065] c)所示的方法包括如下步驟：敲除出發微生物基因組中的LpxA和LptD基因，且 將tat信號肽編碼基因、驅動血紅蛋白表達的啟動子、血紅蛋白編碼基因和合成化合物基 因導入所述出發微生物中，得到重組微生物，發酵所述重組微生物，實現提高微生物發酵細 胞密度；
[0066] d)所示的方法包括如下步驟：將驅動血紅蛋白表達的啟動子、血紅蛋白編碼基因 和合成化合物基因導入出發微生物細胞中，得到重組微生物，發酵所述重組微生物，實現提 高微生物發酵細胞密度。
[0067] 上述出發微生物細胞為革蘭氏陽性或陰性細菌，但不限于大腸桿菌、嗜鹽菌、假單 胞菌或芽孢桿菌；大腸桿菌具體為E. coli TranslTl;嗜鹽菌具體為鹽單胞菌TD 01。
[0068] 以生產聚羥基丁酸酯PHB為例，上述合成化合物基因來源于pBHR68,通過質粒 pBHR68導入出發微生物細胞E. coli TranslTl。本發明的實驗證明，本發明通過基于tat 轉運系統的膜間質血紅蛋白蛋白表達提高細胞密度的方法，可以通過分子（基因）操作來 實現，比如膜間質血紅蛋白的基因操作，包括分別在細胞內或細胞周質空間過表達細胞血 紅蛋白基因等；本發明構建提高細胞密度的工程菌，已實例證明包括可以提高單位體積細 胞積累量、單位體積PHB積累量等的產量，有的工程菌細胞干重提高了 120%。且本發明的 生產工藝簡單，成本低廉，應用前景廣闊。
【附圖說明】
[0069] 圖 1 為質粒 pSEVA331_vgb (左）和 pSEVA331_tat_vgb (右）的結果示意圖。
[0070] 圖 2 為質粒 pSEVA331-gfp (左）和 pSEVA331-tat-gfp (右）的結果示意圖。
[0071] 圖 3 為質粒 pSEVA33l-vgb_meos (左）和 pSEVA33l-tat-vgb_meos (右）的結果不 意圖。
[0072] 圖4為共聚焦顯微鏡觀察Tat轉運系統轉運GFP熒光蛋白定位示意圖。
[0073] 圖5為超分辨顯微鏡觀察VHb蛋白定位不意圖。
[0074] 圖 6 為質粒 pSEVA331_Pporin Tat_vgb_Ag43 的結構示意圖。
[0075] 圖 7 為質粒 pRE112-6ISceI-LpxA(左）和 pRE112-6ISceI-LptD 右）的結構示意 圖。
[0076] 圖8為質粒pSEVA331_Pporin+ala的結構示意圖。
[0077]圖 9 為質粒 pSEVA331_Pporin + vgb + ala(左）和 pSEVA331-Pporin+tat_vgb+ala(右）的結構不意圖。
[0078] 圖10為質粒pSEVA331_Pporin+phaP的結構示意圖。
[0079]圖 11 為質粒 pSEVA331_Pporin + vgb + phaP(左)和 pSEVA331-Pporin+tat_vgb+phaP(右）的結構不意圖。
[0080] 圖12為ALA標準曲線。
【具體實施方式】
[0081] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0082] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0083] 圖1為大腸桿菌重組菌構建示意圖。
[0084] 所用酶試劑均購自ThermoScientific Fermentas公司，提取質粒所用的試劑盒購 自北京博邁德科技發展公司，回收DNA片段所用的試劑盒購自美國omega公司，相應的操作 步驟按照產品說明書進行；所有培養基如無特別說明均用去離子水配制。
[0085] 培養基配方：
[0086] LB培養基含：5g/L酵母提取物（購自英國0XID公司，產品目錄號LP0021)，10g/ L蛋白胨（購自英國0XID公司，產品目錄號LP0042)，10g/L NaCl，其余為水。調pH值至 7.0-7. 2,高壓蒸汽滅菌。
[0087] MM培養基配置方法：2g/L酵母提取物（購自英國0XID公司，產品目錄號LP0021)， 其余為水。溶解后高壓滅菌。冷卻后每50ml加入lml組分I (10g(NH4)2S(VfP 2gMgS04加水 定容至200ml，高壓蒸汽滅菌）和組分II (96. 5g Na2HP04. 12H20和15g ΚΗ2Ρ04，加水定容至 200ml，高壓蒸汽滅菌）。（NH4) 2S04, MgS04, Na2HP04. 12Η20, ΚΗ2Ρ04購自國藥集團化學試劑有 限公司，目錄號分別為 10002992,10034998,10020392,1017628。
[0088] 在實際培養過程中，可向上述培養基中再添加一定濃度的抗生素以維持質粒的穩 定性，如50 μ g/mL氯霉素。
[0089] pBHR68 載體記載在如下文獻中：Spiekermann P，Rehm BHA，Kalscheuer R，Baumeister D，Steinbilchel A (1999) A sensitive, viable-colony staining method using Nile red for direct screening of bacteria that accumulate polyhydroxyalkanoic acids and other storage corn-pounds. Arch Microbiol 171 ： 73-80，該質粒中含有來源于羅氏真養桿菌Ral stonia eutropha的PHB合成基因phaC基因、 β -酮基硫解酶PhaA和NADPH依賴的乙酰乙酰輔酶A還原酶phaB。
[0090] 實施例1、通過細胞內表達VHb血紅蛋白基因提高發酵單位細胞密度
[0091] 一、工程菌的構建
[0092] 1、表達載體 pSEVA331_Pporin+vgb 的構建
[0093] 1)、目的啟動子Pporin的獲得
[0094] 提取鹽單胞菌TD01(Hal〇m〇nas TD01，現保存于中科院微生物研究所菌種保藏中 心，保藏號CGMCC4353 ;專利的公開號CN102816729A)的基因組為模板，以G-Pporin-ITF和 G-Pporin-2TR為引物，用pfu酶進行PCR擴增。
[0095] 引物為：
[0096] G-Pporin-ITF :5' gataacaatttcacacaggacggccgctgagacctgccag 3'
[0097] G-Pporin-2TR :5' ctcctctttctctagtaaagtctgcagctggcttgc 3'
[0098] PCR反應條件：
[0099] 先95°C預變性5分鐘；再95°C變性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸30秒，30次 循環；然后72°C后延伸10分鐘。
[0100] PCR擴增目的片斷（50 μ L體系）：
[0101]
[0102] PCR擴增體系配制時，DNA聚合酶最后加入。
[0103] 得到218bp的PCR產物，為目的基因Pporin，其核苷酸序列為序列表中序列1自 5'末端第33-250位。
[0104] 2)、目的基因vgb的獲得
[0105] 提取透明顫菌（Vitreoscilla)的基因組為模板，以G-vgb-lTF和G-vgb-2TR為引 物，用pfu酶進行PCR擴增。
[0106] 引物為：
[0107] G-vgb-lTF :5' gagaaagaggagaaatactagatgttagaccagcaaacc 3'
[0108] G-vgb-2TR :5' gggttttcccagtcacgacttattcaaccgcttgagcg 3'
[0109] 得到441bp的PCR產物，為目的基因vgb，其核苷酸序列為序列表中序列1自5'末 端第277-717位。
[0110] 3)、載體骨架的擴增
[0111] 以PSEVA331標準質粒為模板，以G-V-1TF和G-V-2TR為引物，用pfu酶進行PCR 擴增。
[0112] 引物為：
[0113] G-V-2TF :5' ggcaggtctcagcggccgtcctgtgtgaaattgttatc 3'
[0114] G-V-2TR :5' gtacgctcaagcggttgaataagtcgtgactgggaaaacc 3'
[0115] 得到2880bp的PCR產物，為載體骨架片段，其核苷酸序列為序列表中序列1自5' 末端第 717-(3565)-33 位。
[0116]將上述（1)、（2)、（3)的DNA片段通過Gibson assembly同源重組方法連接，得到 連接產物，轉化到大腸桿菌TranslTl中，得到轉化子。
[0117] 使用驗證引物F24、R24驗證引物用pfu酶進行PCR擴增得到跑膠條帶，挑選條帶 685b大小的陽性轉化子，提取陽性轉化子的質粒，送去測序，結果為獲得含有上述（1)、（2) 個片段，該質粒記作pSEVA331-Pporin+vgb，其核苷酸序列為序列表中的序列1，質粒的結 構示意圖見圖1的左圖。
[0118] 驗證引物為：
[0119] F24 :5' agcggataacaatttcacacagga 3'
[0120] R24 :5' cgccagggttttcccagtcacgac 3'
[0121] 2、工程菌 Ε· co 1 i Trans 1T1 (pSEVA33 1-Ppor in + vgb)、Ε· co 1 i TranslTl(pSEVA331_Pporin+vgb，pBHR68)和鹽單胞菌 TD01(pSEVA331_Pporin+vgb)的構 建
[0122] 將上述1制備的表達載體pSEVA331_Pporin+vgb用電擊轉化法轉入到 E.coli TranslTl (北京全式金生物科技有限公司⑶501-01)中，獲得重組菌A E.coli TranslTl(pSEVA331_Pporin+vgb)(提取質粒，測序驗證正確）；
[0123] 將 pSEVA331 標準質粒（The Standard European Vector Architecture 惠贈， //seva. cnb. csic. es)用電擊轉化法同時轉入到E. coli TranslTl中，獲得對照菌B E.coli TranslTl (pSEVA331)；
[0124] 將上述1制備的表達載體pSEVA331-Pporin+vgb和pBHR68用電擊轉化法同時轉 入到E.coli TranslTl 中，獲得重組菌C E.coli TranslTl(pSEVA331_Pporin+vgb，pBHR68) (提取質粒，測序驗證正確）；
[0125] 將pSEVA331標準質粒和pBHR68用電擊轉化法同時轉入到E. coli TranslTl中， 獲得對照菌 D E.coli TranslTl (pSEVA331，pBHR68);
[0126] 將上述1獲得的pSEVA331_Pporin+vgb接合轉化入鹽單胞菌TD01 (Fu, X. -Z. et al.Development of Halomonas TDOlas a host for open production of chemicals. Metabolic engineering 23,78-91(2014).公眾可從清華大學獲得），得到重組菌株 TD01 (pSEVA331_Pporin+vgb)(提取質粒，測序驗證正確）。
[0127] 將pSEVA331標準質粒接合轉化入鹽單胞菌TD01，得到對照菌株TD01 (pSEVA331)。
[0128] 二、工程菌 E. co 1 i Trans 1T 1 (pSEVA33 1-Pporin + vgb)、E. co 1 i TranslTl (pSEVA331)、E.coli TranslTl (pSEVA331-Pporin+vgb，pBHR68)、E.coli TranslTl (pSEVA331，pBHR68)、TD01(pSEV