細胞穿透肽、包含該肽的綴合物、及包含該綴合物的組合物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及源自人端粒酶逆轉錄酶（human telomerase reverse transcriptase ;hTERT)的細胞穿透肽、細胞穿透肽及活性成分的綴合物、以及包含該綴合 物的組合物。
【背景技術】
[0002] 盡管低分子量物質、核酸、蛋白質、納米粒子等在分子水平上具有作為治療物質的 極大可能性潛力，但低分子量物質、核酸、蛋白質、粒子等的使用其應用由于不能無能力穿 透組織及細胞膜而受限。輸送此類物質至細胞內的的系統的開發展已成為過去二十年來活 躍的研宄領域。細胞內部運輸物質已成為分子處理治療方法中的的話題。低分子量物質、 核酸或納米粒子通過系通過多種若干試劑、電穿孔或熱休克而運送到運輸到細胞內。然而， 難以找到一種適當方法在不破壞蛋白質的活性及完整性的情況下將蛋白質輸送到在細胞 內部輸送蛋白質。在20世紀80年代，在對人類人免疫缺乏病毒（human immunodeficiency virus ;HIV)的細胞穿透能力進行的研宄中，已發現，由特定的11種個氨基酸構組成的的 HIV-TAT蛋白質在于在向細胞內部的運輸的過程中起重要作用。因此，在20世紀90年代， 探索運輸到細胞內蛋白質將蛋白質運輸到細胞內的恰當方法的研宄成為重點研宄領域。
[0003] 已知端粒是染色體末端發現的遺傳物質重復序列，端粒防止染色體損傷或防止合 并至其它染色體上。端粒的長度在每次細胞分裂時縮短，且在一定次數的細胞分裂的后，端 粒長度極度縮短至細胞停止分裂且死亡的程度。在另一方面，已知端粒延伸可延長細胞的 壽命。作為實例，癌細胞分泌稱為端粒酶的酶，該酶防止端粒縮短，因此導致癌細胞增殖。
[0004] 本發明的目標在于提供一種新型肽。
[0005] 本發明的另一目標在于提供編碼該新型肽的多核苷酸。
[0006] 本發明的另一目標在于提供細胞穿透肽。
[0007] 本發明的另一目標在于提供作為細胞內活性成分的載體的有用的肽。
[0008] 本發明的另一目標在于提供作為細胞內活性成分的載體的有用的肽，尤其是將活 性成分局部地輸送至粒線體的有用的肽。
[0009] 本發明的另一目標在于提供用于輸送活性成分至粒線體以改善、預防或治療粒線 體相關疾病或病癥的有用的肽。
[0010] 本發明的另一目標在于提供活性成分與細胞穿透肽綴合成的綴合物。
[0011] 本發明的另一目標在于提供包含活性成分與細胞穿透肽的綴合物的組合物。
[0012] 本發明的另一目標在于提供包含活性成分與細胞穿透肽的綴合物的藥物組合物。
[0013] 本發明的另一目標在于提供包含活性成分與細胞穿透肽的綴合物的功能性化妝 組合物。
[0014] 本發明的另一目標在于提供包含活性成分與細胞穿透肽的綴合物的健康食品組 合物。
[0015] 本發明的另一目標在于提供包含活性成分與細胞穿透肽的綴合物的對比造影劑。

【發明內容】

[0016] 根據本發明的一個實施方式的綴合物可為細胞穿透載體肽與活性成分的綴合物， 其中所述載體肽為包含SEQ ID NO:2至SEQ ID NO: 178中至少一個氨基酸序列的肽、與上 述序列具有至少80%同源性的肽、或上述肽的片段，且其中具有至少80%同源性的所述肽 和所述片段保留SEQ ID NO:2至SEQ ID NO: 178中的任一氨基酸序列的細胞穿透能力。
[0017] 根據本發明中的綴合物的另一實施方式，所述片段可由3個或更多氨基酸構成。
[0018] 根據本發明中的綴合物的另一實施方式，所述載體肽可由30個或更少氨基酸構 成。
[0019] 根據本發明中的綴合物的另一實施方式，所述載體肽可為由SEQ ID N0:2至SEQ ID NO: 178中任一氨基酸序列構成的肽或與上述序列具有至少80%同源性的肽。
[0020] 根據本發明的一個實施方式的對比造影劑可包含上述的任一種綴合物。
[0021] 根據本發明的一個實施方式的對比造影劑可用于細胞對比造影。
[0022] 根據本發明的對比造影劑的另一實施方式，所述細胞可為干細胞。
[0023] 根據本發明的一個實施方式的組合物可包含上述的任一種綴合物。
[0024] 根據本發明的組合物的另一實施方式，所述活性成分可用于治療或預防疾病，且 所述組合物可為藥物組合物。
[0025] 根據本發明的組合物的另一實施方式，所述活性成分可為用于功能性化妝品的活 性成分，且所述組合物可為化妝品組合物。
[0026] 根據本發明的組合物的另一實施方式，所述活性成分可為用于功能健康食品的活 性成分，且所述組合物可為健康食品組合物。
[0027] 根據本發明方法的一個實施方式為用于輸送活性成分至細胞內的方法，其中該方 法包括對有需要的對象施用權利要求1至12中任一項所述的綴合物，且其中載體肽為將活 性成分輸送至細胞內的細胞穿透肽，且其中具有至少80%同源性的所述肽及上述肽的片段 保留由SEQ ID N0:2至SEQ ID NO: 178中任一氨基酸序列構成的肽的細胞穿透能力。
[0028] 根據本發明的方法的另一實施方式，所述方法可用于將所述活性成分局部地輸送 至細胞內部的粒線體內。
[0029] 根據本發明細胞穿透肽的另一實施方式，上述載體肽可以為具有SEQ ID NO:2至 SEQ ID NO: 178中任意一個或多個氨基酸序列的肽。
[0030] 根據本發明的多核苷酸可編碼上述細胞穿透肽。
[0031] 根據本發明的載體可包含上述多核苷酸。
[0032] 根據本發明的轉化細胞可包含上述載體。
[0033] 產業利用性
[0034] 難以運輸到細胞內的活性成分可通過使用本發明所公開的肽或肽及活性成分的 綴合物而易于運輸到細胞內。這意味著可增加活性成分的功效且因此可減少活性成分的劑 量。因此，可最小化由于藥物施用造成的副作用且可增加治療的有效性。特別地，當將藥物 局部地輸送至粒線體內時，可改善粒線體相關的疾病或病癥，且可增加疾病預防及治療疾 病的有效性。在化妝品的情況中，通過少量活性成分可產生顯著效果。通過使肽與對比造 影物質綴合，可將該肽用作對比造影物質以監測細胞移植的過程或在細胞治療中的移植細 胞。特別地，該肽可實際上用作用于注入身體內的干細胞的對比造影物質。
【附圖說明】
[0035] 圖1描繪通過FACS分析的在FITC與SEQ ID No: 1的肽P印1融合后治療的HeLa 細胞中細胞攝入的細胞數量。對照細胞僅以FITC處理。
[0036] 圖2至圖29描繪通過FACS分析的在FITC與SEQ ID NO: 2至SEQ ID NO: 178的 肽融合后治療的HeLa細胞中細胞攝入的細胞數量。對照細胞僅以FITC處理。
[0037] 圖30至圖51描繪通過FACS分析的在FITC與SEQ ID NO: 2至SEQ ID NO: 178的 肽融合后治療的Huh7細胞中細胞攝入的細胞數量。對照細胞僅以FITC處理。
[0038] 圖52至圖69描繪通過FACS分析的在FITC與SEQ ID NO: 2至SEQ ID NO: 178的 肽融合后治療的人T淋巴球細胞系（Jurkat細胞）中細胞攝入的細胞數量。對照細胞僅以 FITC處理。
[0039] 圖70描繪通過FACS (流式細胞術）分析的在FITC與SEQ ID No: 1的肽P印1融 合后治療的HeLa細胞的毒性及細胞活性的結果。對照細胞僅以FITC處理。
[0040] 圖71至圖86描繪通過FACS (流式細胞術）分析的在FITC與SEQ ID NO: 2至SEQ ID NO: 178的肽融合后治療的HeLa細胞的毒性及細胞活性的結果。對照細胞僅以FITC處 理。
【具體實施方式】
[0041] 盡管蛋白質、核酸、肽或病毒等具有作為治療物質的極大可能性潛力，但蛋白質、 核酸、肽或病毒等的使用由于無能力不能穿透組織及細胞膜而受限。即使分子大小很小， 但該等這種分子由于分子的結構或特性而無法穿透脂質雙層。因此，試圖經由通過使用 電穿孔、熱休克等將蛋白質、核酸、肽或病毒運輸到細胞內；難以在既不破壞細胞膜又保持 上述分子的活性狀態的情況下轉移彼等所述蛋白質、核酸、肽或病毒。已進行的許多研宄 顯示源自人免疫缺乏病毒（Human Immuno-deficiency Virus ;HIV)的反式轉錄活化因子 (Trans-Activating Transcriptional activator ;TAT activator)蛋白質可用作細胞穿 透肽，該細胞穿透肽可將巨極大的活性物質到運輸細胞內。具體地，已進行了關于下列物質 的研宄，與在細胞內部產生毒性的TAT蛋白質不同，該等該物質可在不產生任何毒性的情 況下運輸諸如蛋白質、核酸、肽或病毒的極巨大分子到細胞內。因此，本發明是通過本發明 人發現源自端粒酶的肽具有作為細胞穿透肽的顯著功效而無顯著明顯毒性而完成的。
[0042] 肽在下表1至下表5中所示的SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 178公開。SEQ ID NO: 179是人端粒酶蛋白質的全長序列。SEQ ID NO: 1的肽源自端粒酶，由16個氨基酸序列 組成。SEQ ID NO:2 至 SEQ ID NO:77 的肽包括 SEQ ID NO: 1 的肽。SEQ ID NO:78 至 SEQ ID NO: 178的肽為SEQ ID NO: 1的肽的片段。下表1中的"名稱"系用于區別肽。在本發明 的不同特定實施方式中，在SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 178中超過一個肽包括"合成肽"， 即，端粒酶的選定區域的合成肽。在本說明書中，術語"pep"在本文系指具有SEQ ID N0:1 的序列、或SEQ ID NO: 2至SEQ ID NO: 178中任一氨基序列者的肽、包含與上述序列具有超 過80%同源性的氨基酸序列的肽或上述肽的片段。
[0043] [表 1]
[0044]
[0045] [表 2]






[0053] 在本發明的一個實施方式中，一種多核苷酸編碼以下的肽：包含SEQ ID N0:2至 SEQ ID NO: 178中至少一個氨基酸序列的肽，與上述序列具有至少80%同源性的肽或作為 上述肽的片段的肽。如上所述的多核苷酸能夠使得所述肽大量地產生。舉例而言，培養包 括編碼肽的多核苷酸的載體使得肽大量產生。
[0054] 本文公開的肽可包括包含同源性超過80 %、超過85 %、超過90 %、超過95 %、超過 96 %、超過97 %、超過98 %、超過99 %的氨基酸序列的肽。此外，本發明中所公開的肽可包 括：包含SEQ ID NO: 2至SEQ ID NO: 178中任一氨基酸序列的肽或該肽的片段，及