一種信號肽及其在利用魔芋粉產l-鳥氨酸重組菌中的應用
【技術領域】
[0001] 利用一種信號肽使重組菌高效分泌特定酶代謝廉價碳源進行氨基酸生產的方法 和高效生產某種蛋白的方法，屬于基因工程、蛋白質與酶工程和代謝工程領域。
【背景技術】
[0002] 魔芋粉，主要含魔芋葡甘露聚糖，其來源是非糧食作物魔芋。據相關報道在我國云 南、貴州、四川、湖北和湖南的西部、陜西南部等地均適宜魔芋種植，目前已有一定的規模， 僅湖北省魔芋種植面積就達41萬畝。目前魔芋粉主要用于部分食品，其水解低聚糖可作為 功能性食品，應用還不是很廣泛。大部分微生物無法直接利用，因此，改造微生物利用魔芋 作為碳源發酵生產高附加值產品具有良好的應用前景。現國內外已有報道，改造釀酒酵母 直接以淀粉為碳源生產乙醇，導入α-淀粉酶基因使谷氨酸棒狀桿菌利用可溶性生產L-賴 氨酸的相關報道，未見有以魔芋粉底物的相關微生物改造。
[0003] 發明人前期工作已獲得通過相關基因工程和代謝工程技術改造的高產L-鳥氨酸 的菌種：鈍齒棒狀桿菌CGMCCNO. 0890/pargI，并申請發明專利：一種利用重組鈍齒棒桿菌 一步發酵法生產L-鳥氨酸的方法。
[0004] 發明人獲得的高產L-鳥氨酸的菌種只能以葡萄糖為主要碳源發酵生產L-鳥氨 酸，不能直接利用魔芋粉作為主要碳源。
[0005] L-鳥氨酸是一種重要的非蛋白質氨基酸，可促進蛋白質的合成以及糖類和脂質的 分解代謝并對肝臟的解毒功能具有重要的保障作用。通過基因工程和代謝工程技術進一步 改造高產L-鳥氨酸菌種，使其能利用魔芋粉作為碳源發酵生產L-鳥氨酸。對簡化L-鳥氨 酸生產工藝、節約生產成本有一定的參考應用價值。

【發明內容】

[0006] 本發明通過基因工程技術將去除自身信號肽的甘露聚糖酶基因與來源谷氨 酸棒狀桿菌和枯草芽孢桿菌的Sec和Tat兩個主要分泌途徑的十二條信號肽分別融合，替 換對比不同信號肽引導分泌β-甘露聚糖酶基因在不同L-鳥氨酸高產菌的效果，得到經密 碼子優化的β-甘露聚糖基因信號肽--Mannase Signal Peptide (MSP)為分泌胞外酶效 果較好的一種新發現信號肽。
[0007] 所述MSP核苷酸序列是SEQ ID NO. 1所示的序列。
[0008] 本發明在已有高產L-鳥氨酸菌種的基礎上，通過基因工程技術不同信號肽引導 分泌β-甘露聚糖基因在構建的不同L-鳥氨酸高產菌中表達。使其能以魔芋粉和葡萄糖 作為混合碳源發酵生產L-鳥氨酸。
[0009] 所述高產L-鳥氨酸菌種為本研究室前期構建的鈍齒棒狀桿菌CGMCCΝ0.0890/ pargI〇
[0010] 本發明構建的重組鈍齒棒狀桿菌CGMCCNO. 0890/pargI-pMSPman優化后5L發酵 96hL-鳥氨酸的產量為23. 5±0. 7g/L，發酵液中β-甘露聚糖酶的酶活為1358±3. 7U/mL。 (碳源添加方式：初始l〇g/L魔芋粉和50g/L葡萄糖，后期分批補加90g/L魔芋粉）。
[0011] 所述的技術方案：
[0012] 1.根據NCBI上公布的相關基因序列設計信號肽和目的基因融合引物。
[0013] 2.重組菌的構建
[0014] 從相關菌種中抽提染色體DNA為模板，根據預先設計好的引物、PCR擴增條件和擴 增體系進行PCR。采用凝膠回收試劑盒對PCR產物進行純化和回收，瓊脂糖核酸凝膠電泳 檢驗回收產物的濃度。用相同的限制性內切酶相關表達載體和純化后的PCR產物進行雙酶 切，瓊脂糖核酸凝膠電泳檢測酶切產物并用凝膠回收試劑盒對其回收，并用超微量分光光 度計檢測其濃度。將酶切后的載體和PCR產物按一定比例混合，在T4DNA連接酶的作用下 過夜連接。將連接產物用CaCl2轉化法轉入E.coliBL21，獲得含重組質粒的E.coliBL21。 提取質粒，通過單雙酶切及PCR驗證后用電轉化方法將重組質粒導入相關菌種中。最后，將 含15%甘油的重組菌液保存-70°C冰箱。
[0015] 3.重組菌的產酸培養
[0016] 將重組菌接種于新鮮的LB+0. 5%Glucose液體培養基中進行活化，接種量為1 %。 次日以1%轉接于發酵培養基中（底物為可溶性淀粉和葡萄糖混合），0.8mMIPTG誘導表 達，生長后期收集發酵液利用氨基酸自動分析儀測定其氨基酸含量（L-鳥氨酸及相關氨基 酸等）。發酵培養基具備微生物生長所需的營養成分，并通過相關優化。
[0017] 4.重組菌的產酶培養
[0018] 將重組菌接種于新鮮的LB+0. 5%Glucose液體培養基中進行活化，接種量為1 %。 次日以1 %轉接于發酵培養基中（底物為葡萄糖），0. 8mMIPTG誘導表達，生長后期收集發 酵液測其酶活和蛋白含量。
【具體實施方式】
[0019] 實施例1 :信號肽引物與β-甘露聚糖酶串聯的引物設計
[0020] 根據NCBI上公布的相關基因序列和β-甘露聚糖酶基因序列設計信號肽和基因 串聯的大片段引物。
[0021] Pl:pMSPmanHindIIIF
[0022] 5'-CCCAAGCTTATGTTCAAGAAGCACACCATCTCCCTGCTGATCATCTTCCTGCTGGCT
[0023]TCCGCTGTTCTGGCTAAGCCAATCGAGGCTCATACTGTGTCGCCTGTGAATC-3 '
[0024] P2:pMSPmanHindIIIR
[0025] 5' -CCCAAGCTTTTACTCAACGATTGGCGTTA-3'
[0026] 實施例2 :β-甘露聚糖酶基因信號肽替換及其克隆
[0027] [1]從Β.subtilisCCTCCΜ209200 提取染色體作為模板DNA。
[0028] [2]根據NCBI網站上公布的β-甘露聚糖酶基因序列設計信號肽和基因串聯的 PCR引物。以B.subtilisCCTCCΜ209200的基因組為模板利用大片段引物PCR，得到帶有 經密碼優化的核苷酸序列如SEQIDΝ0:1所示Mannasesignalpeptide(簡稱MSP)信號肽 的β-甘露聚糖酶基因。PCR擴增體系（50yL):模板lyL，上下游引物各0. 5yL，dNTPMix 4μL，10XExTaqBuffer5μL，滅菌ddH20 38. 5μL，ExTaqDNA聚合酶 0· 5μL。PCR反 應條件：94°C預變性，5min，一個循環；94°C變性，3〇8,56°(：退火，3〇8,72°(：延伸，11^113〇8， 30個循環；72°C，10min，一個循環；4°C，10min，一個循環（其中退火溫度和延伸時間根據不 同引物和基因進行相對的調節）。采用凝膠回收試劑盒對PCR產物進行純化和回收，電泳檢 驗回收產物的濃度。回收產物存放在1. 5mL的離心管中，-20°C冰箱保存備用。
[0029] 實施例3 :重組質粒pDXWlO-MSPman的構建
[0030] [1]構建重組質粒pMD18-T-MSPman，導入E.coliJM109。將[2]中PCR回收的產 物與克隆載體PMD18-T連接，連接體系為solutionI5μL，目的基因4. 8μL，pMD18-T質 粒0. 2μL，16°C過夜連接。連接接產物轉化E.coilJM109,涂布于含100ug/mL氨芐青霉素 的LB平板，經37°C培養過夜，挑取單菌落到含100ug/mL氨芐青霉素的10mL液體LB培養 基中，37°C搖床過夜培養后提取質粒，命名為pMD18-T-MSPman，經PCR和酶切驗證連接成功 后，將菌液加入甘油于-70 °C冰箱保藏。
[0031] [2]將[1]中提取的pMD18-T-MSPman質粒與表達載體pDXWlO分別進行Hindlll 與EcoRI的雙酶切，利用凝膠回收試劑盒回收后進行連接，獲得重組質粒pDXWlO-MSPman。 上述重組質粒都通過PCR和酶切驗證。
[0032] 實施例4:重組質粒pDXWlO-MSPman電轉化至鈍齒棒狀桿菌CGMCC N0.0 890/pargI
[0033] 挑取鈍齒棒狀桿菌CGMCCNO. 0890/pargI分別接種于10mLLB液體培養基搖瓶 中，30°C搖床培養過夜，取100μL過夜培養的菌液，接種于50mL的感受態培養基中，30°C搖 床培養4h至0D562nm= 0. 9左右，用無菌管離心去上清，再用10%的甘油懸浮菌體并離心， 重復此步驟3次。最后分裝于1. 5mL的離心管，加入3uL重組