規方法。所用試劑的來源、 商品名，均在首次出現時標明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均與首次標明的相同。本 發明實施例中涉及的由發明人保存的生物材料，均可向公眾提供20年。
[0023] 實施例1:營養多肽/7/基因的克隆、測序及鑒定 通過PCR的方法從公司購買的合成DNA片段(上海生工）中擴增獲得營養多肽NP的基 因。
[0024] 營養多肽/7/基因片段的PCR擴增引物為： Np-F：GGGGTACCCCGACGATGACGATAAGCTGAAGGTGACCATCAAGAC Np-R：CGGAATTCCGTCACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGr(XTTGGTCACCAGCAGGATCAC PCR反應體系按7???L4hi/使用說明書嚴格進行，20yL反應體系中含7???L4 7^ 0· 2μL，10XLAPCRBufferII(Mg2+Plus) 2μL，dNTPMixture(各 2. 5mM) 3. 2μL， 模板DNA100ng，上下游引物（20μM)各0.4μL，最后加滅菌超純水補齊到20μL。PCR條件 為：94°C變性 5min，94°Clmin，56°C40s，72°C40s，30 個循環。PCR產物大小為 180bp，包 括營養多肽λ/?基因的編碼序列。擴增片段按TaKaRapMD18_TSimpleVector(TaKaRa，寶 生物工程(大連)有限公司）說明書的方法，克隆于PMD18-T載體中，轉化大腸桿菌DH5α，篩 選克隆菌株，提取質粒，通過PCR及及wl和及雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆， 并對重組質粒進行測序，克隆片段的測序由百奧邁科（Biomics)生物技術有限公司完成。 克隆的重組質粒命名為PMD18-T-NP，重組子菌株命名為DH5a/PMD18-T-NP。陽性重組菌株 保存在含有15%甘油的LB培養基中，凍存于-80 °C。
[0025] 實施例2 :以CotC為載體表面展示NP的枯草芽孢桿菌重組芽孢的制備與應用 1.重組整合型質粒PJS700-NP的構建 質粒pJS700(李倩.以CotX為分子載體表面展示WSSV囊膜蛋白Vpl9和Vp28的枯草 芽孢桿菌重組芽孢的研究[D].江蘇鎮江：江蘇大學，2010:36-38)由江蘇大學環境學院寧 德剛副教授惠贈，該質粒大小約為5. 5kb。在pJS700質粒中，awjf5'_end和awjf3'_end 分別表示淀粉酶基因(GeneBank序列號：NP_388186)編碼序列的5'端和3'端，通過 同源重組整合在168 (?τρ)染色體的淀粉酶基因中。辦別表 示氨節青霉素抗性基因和紅霉素抗性基因，在大腸桿菌和SaciWiAs· 168 (?τρ) 中作為篩選標記。Enterokinase表示腸激酶消化的標簽位點Asp-Asp-Asp-Asp-Lys。coiC為枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白CotC基因，該基因片段含有coii基因（GeneBank序列號： NP_389653)的啟動子序列、不含有coii終止密碼子的CotC編碼序列；oriC為大腸桿菌復 制子片段。
[0026] 分別用及wl和及酶切質粒PMD18-T-NP和pJS-700,用瓊脂糖凝膠回收試劑盒 回收耶片段和pJS-700,用T4DNAligase連接兩雙酶切后純化好的片段，連接產物轉化大 腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化物涂布于含有50μg/mL氨芐青霉素的LB平板中37°C培養 過夜，次日挑選陽性單克隆菌株于含有50μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，37°C培養 12至16h，提取質粒，通過PCR及及wl和及^I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，鑒 定正確后將重組整合型質粒命名為PJS700-NP，陽性重組菌株命名為DH5a/PJS700-NP。該 重組整合型質粒PJS700-NP中含有腸激酶標簽的重組基因該質粒的構建過程及 其圖譜見圖2。
[0027] 2.融合表達重組芽孢的枯草芽孢桿菌菌株的篩選與鑒定 將整合型重組質粒PJS700-NP轉化ifeciUiA? 168 (?τρ)(Bacillus GeneticStockCenter,DepartmentofBiochemistry,TheOhioStateUniversity,West12thAvenue,Columbus,Ohio, 43210，USA)，用含有 0.4μg/mL紅霉素（購自SIGMA 公司）的LB平板篩選重組子，從平板上挑選單菌落接種于含1%淀粉的LB平板中，37°C過夜 培養，次日用碘-碘化鉀溶液對淀粉平板染色來鑒定重組菌株。
[0028] 1%淀粉平板的制備方法：100mL LB固體培養基中加可溶性淀粉0.lg，高壓蒸汽滅 菌后倒制平板。
[0029] 碘-碘化鉀溶液的配制：碘化鉀2g，碘lg，蒸餾水300mL，先將碘化鉀溶于少量去 離子水中，待全部溶解后再加入碘，振蕩溶解后稀釋至300mL，避光保存在棕色玻璃瓶中，用 時可稀釋2~10倍。
[0030] 取適量碘-碘化鉀溶液滴于淀粉平板上，菌落周圍產生透明圈表明重組基因沒有 插入淀粉酶基因中，菌落及其周圍顏色變藍表明重組基因成功的插入到了你ciWM 168(?τρ)染色體上的淀粉酶基因中，因而導致淀粉酶基因必沒有活 性，見圖3。
[0031] 為了進一步證明重組菌株中淀粉酶基因的失活是由于及的插入所致， 分別以amyE-F/amyE-R、np_F/np-R、amyE_F/np-R、np-F/amyE_R為引物對，以枯草芽孢桿 菌的染色體為模板，PCR擴增鑒定重組菌株中是否含有Ai-co忙基因片段。Ai-co忙-耶 片段在168 (?τρ)染色體中的整合示意圖見圖4。PCR反應體系按 7???L4 使用說明書嚴格進行，20yL反應體系中含7???L4 7^ 0. 2yL，10XLA PCRBufferII(Mg2+Plus) 2yL，dNTPMixture(各 2.5mM)3.2yL，模板DNA100ng，上下 游引物（20μM)各0. 4μL，最后加滅菌超純水補齊到20μL。PCR反應條件根據各個引物對 的特征分別設置。在重組菌株中分別檢測到約180bp、730bp、3000bp，而野生型菌株中只檢 測到約1. 1kp的淀粉酶基因，鑒定結果見圖5。這表明重組菌株染色體上含有 重組基因，并且運:組片段成功的插入到了淀粉酶基因中。將鑒定后的重組菌 株命名為 168 (irp)/pJS700-NP〇
[0032] 枯草芽孢桿菌染色體的提取方法為：挑單菌落接于LB加相應抗生素的培養基中， 在37 °C搖床中培養至0D6。。為1. 0~2· 0。取1. 5mL菌液于Eppendorf管中，8000rpm離心 10min，棄上清，加 100μLpH8. 0 的TE緩沖液（10mMTris-HCl，1mMEDTA)洗沉淀，離心 去上清，再加100μLTE懸浮沉淀；向懸浮液中加30μL100mg/ml溶菌酶溶液，不要搖晃， 在37°C培養箱中放lh，加50μL10%SDS和20μL20mg/mL蛋白酶K，37°C繼續培養lh;補 TE至300μL，分別加150μL苯酚和氯仿抽提，12000rpm離心10min，取上清；再加300μ1 氯仿，12000rpm離心5min，取上清，加1/4體積5Μ的NaCl，2倍體積的無水乙醇，室溫下沉 淀DNA2h，12000rpm離心10min，收集沉淀，用500μL70%的乙醇洗沉淀，待揮發干后，加 10μLΤΕ緩沖液溶解沉淀，取1μL用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度，剩余的可放于-20°C 中保存備用。
[0033] 3.表面展示營養多肽重組芽孢的誘導及鑒定 用DSM培養基誘導重組菌株你ciWM仰168 (?ιρ)/ρΡ700-ΝΡ形成芽孢。DSM培養基的配方為：〇· 8%nutrientbroth(營養肉湯Difo)，0. 1%KC1，0. 025%MgS04 · 7Η20， l.OmMCa(N03)2.4H20，l(^MΜη(：12，1·〇μΜFeS04。將野生型菌株你168 (?ιρ)和重組菌株分別接種于DSM培養基中，重組菌株分別取8h和48h培養物進行處理， 野生型菌株取48h的培養物進行處理。
[0034] 芽孢蛋白的處理方法：12000rpmX10min離心收集菌體，重懸于相同體