一種蘋果酸酶基因rkme2及其重組表達載體的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種蘋果酸酶(Malic enzyme)基因及其重組表達載體，具體涉及以紅冬抱酵母(Rhodosporidium kratochvilovae) YM25235 cDNA為模板，擴增得到編碼蘋果酸酶(ME)的基因欣通5么將其連接至表達載體，進一步轉化至大腸桿菌BL21中，誘導表達，鎳柱親和層析純化重組蛋白，并對純化后的蛋白進行了酶活測定。屬于微生物基因工程和酶工程領域。
【背景技術】
[0002]蘋果酸酶(malic enzyme，ME)是調控蘋果酸代謝的關鍵酶，可以催化蘋果酸進行氧化脫羧為丙酮酸和C02，同時伴隨著NAD(P)+的還原；蘋果酸酶普遍存在于生物體內；根據輔酶因子的不同，蘋果酸酶可分為兩種:NAD_蘋果酸酶(NAD-Malic enzyme ；NAD-ME ；EC 1.1.1.38 和 EC 1.1.1.39 )和 NADP-蘋果酸酶(NADP-Malicenzyme ;NADP_ME ；EC1.1.1.40。本發明主要是針對NADP-蘋果酸酶)基因進行研究。
[0003]通常認為，NADP-ME為各種細胞組分的合成提供還原力NADPH。例如在產油微生物油脂合成代謝調控中，NADP-ME持續為脂肪酸合成酶進行鏈延伸提供NADPH (Song Y D,Wynn J P, et al, Microbi, 2001, 147 (6):1 507-1 515.)。NADP-蘋果酸酶在植物的生長代謝及發育過程中也扮演著重要角色，植物中蘋果酸酶的底物和產物參與多種代謝途徑，包括光合作用和呼吸作用。如熱帶C4植物中的固碳作用，保持植物細胞的滲透勢，穩定細胞質的PH和保持植物根系的離子吸收平衡起重要作用，是生物體生命活動中重要的酶之一(Drincovich M F，Casati P, Andreo C S, FEBS Letters, 2001,490:1-6.4 ；Martinoia E， Rentsch D， Annual Review of Plant Phys1logy and PlantMolecularB1logy, 1994，45: 447- 467.)。此外，植物NADP-ME被認為參與植物防御反應。另有報道表明，NADP-ME參與了果實的成熟，通過蘋果酸代謝來平衡細胞內的pH，還通過代謝提供碳源和NADPH調節一些底物及輔助因子來參與脂肪酸的合成。
[0004]NADP-ME也是景天酸代謝途徑(CAM)植物的一種重要脫羧酶，酶活性晝高夜低；兼性CAM植物隨著C3光合型向CAM型轉化，其NADP-ME酶活性涿漸升高，干旱誘導CAM植物其NADP-ME酶活性比C3增加3倍，由此表明:NADP_ME在CAM植物的活性調節中起重要作用。在CAM運行和調節中，NADP-ME和PEP (磷酸烯醇式丙酮酸)羧化酶一樣，具有重要調節作用(王晨，西北植物學報，1997，17 (2): 200-204.)。
[0005]蘋果酸酶作為生物體中樞代謝途徑的關鍵酶，也可應用于厭氧混合酸的發酵工程及釀酒工業。因此本發明通過發掘高效、特異性新基因蘋果酸酶MI3410ME1，與pET-32a(+)質粒進行重組，并實現在E.coli BL21中表達。為蘋果酸酶應用于工業和農業奠定基礎。

【發明內容】

[0006]本發明的目的是提供一種從紅冬抱酵母(Rhodosporidium kra tochvilovae)YM25235中分離的蘋果酸酶基因及該基因編碼的氨基酸，該基因核苷酸序列如SEQID NO: 1所示，或與SEQ ID NO: 1互補的核苷酸序列，該基因序列長為1911bp (堿基)，其中
1-1911為編碼蘋果酸酶成熟多肽的開放閱讀框；該基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0007]本發明的另一目的是提供一種含有蘋果酸酶基因欣重組表達載體pET32aRKME2，該重組表達載體是將SEQ ID NO: 1所示基因直接與載體pET32a ( + )所構建的重組表達載體。
[0008]本發明另一目的是提供一種含有上述的蘋果酸酶基因或上述的重組表達載體的宿主表達細胞，比如大腸桿菌BL21菌株。
[0009]本發明提供的核苷酸序列SEQ ID NO: 1是一種高效、特異性的蘋果酸酶基因，將其與表達載體連接后轉化至宿主細胞內生產蘋果酸酶，具有產物特異性高、生產周期短、生產不受季節、氣候的影響，可以通過利用轉化至不同的宿主細胞來開發商業化蘋果酸酶等優點。本發明應用基因工程技術構建蘋果酸酶重組表達載體pET32a RKME2，將其轉化至大腸桿菌生產蘋果酸酶，具有操作簡單、成本低、可行性高等優點，為蘋果酸酶基因工程化生產奠定基礎。
【附圖說明】
[0010]圖1為本發明蘋果酸酶基因構建的大腸桿菌重組表達質粒pET32a RKME2圖譜；
圖2為本發明的蘋果酸酶基因誘導表達并純化后的SDS-PAGE分析圖:其中:1為蛋白電泳Marker ;2為轉化了 pET32a ( + )并經過IPTG誘導的大腸桿菌BL21總蛋白；3為轉化了 pET32aRKME2并經過IPTG誘導的大腸桿菌BL21總蛋白；4為純化的目的蛋白條帶。
【具體實施方式】
下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細說明，但本發明保護范圍不局限于所述內容，實施例中使用的試劑和方法，如無特殊說明，均采用常規試劑和使用常規方法。
[0011 ] 實施例1:紅冬孢酵母YM25235蘋果酸酶基因的克隆米用 0MEGA 試劑盒 E.Z.N.A Fungal RNA Kit 從紅冬抱酵 ^iRhoclosporidiim克ra1cAKiJoKae) YM25235 中提取總 RNA，用反轉錄試劑盒 Thermo Scientific Maxima ΗMinus First Strand cDNA Synthesis Kit 合成 cDNA，取 1 μ 1 cDNA 為模板進行聚合酶鏈式反應；設計引物(引物1和引物2)進行PCR擴增，反應所用引物、組分和擴增條件如下:引物 1:RKME2-F1:5'- ATGCCCGCCCCGACGACGCTCCTCGGCGCT-3' (SEQ ID N0:3)
引物 2:RKME2-R1:5'_ TCAGACGTCAACGAGCTCGAGGGGGCGGTA-3' SEQ ID NO:4)
PCR擴增體系(50 μ L)組成如下:
5XFast Pfu Buffer10 μ L
dNTP (2.5 μπιοΙ/L)5 yL
模板 cDNA1 μ L
RKME2F (10ymol/L)1 yL
RKME2R (10ymol/L)1 yL
Fast Pfu DNA polymerase (5U/μ L) 1 μ L無菌ddH20補足至50 μ L ; 擴增條件:94°C變性4min，再用94°C 40s、58.0°C 40s、72°C 2min進行30個循環，最后72°C lOmin，反應完后取產物1 μ L，然后在濃度為1%的瓊脂糖凝膠中，進行電泳分析。經凝膠成像系統成像確認片段大小正確后，用百泰克生物技術有限公司多動能DNA純化回收試劑盒回收目的片段，然后將PCR擴增得到的目的基因連接到pMD18-T上，連接產物轉