一種小鼠rankl突變體表達載體及其構建、表達及應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物學、分子生物學及基因工程技術領域，具體涉及一種具有生物 活性的不同半胱氨酸位點（Cys)突變的小鼠核因子KB受體活化因子配基（RANKL)的突變 體表達載體及其構建、表達及應用。
【背景技術】
[0002] 骨骼具有為了自身的形態變化和維持血鈣濃度而重復形成和吸收、進行重建的動 態平衡特征。正常的骨豁通過由成骨細胞、骨細胞介導的骨形成及由破骨細胞介導的骨吸 收而處于動態平衡狀態。骨骼動態平衡的維持是一個多因素、多環節的復雜調控過程，而成 骨細胞、骨細胞與破骨細胞間的信號耦聯是核心。這種信號耦聯是由一系列的分泌性蛋白 在起著關鍵的調控作用，而其中最為重要的便是到目前為止研究最為透徹的核因子κΒ受 體活化因子配基（receptoractivatorofNF-κBligand，RANKL)。
[0003] 在骨骼系統中，RANKL主要由成骨細胞、骨細胞表達和分泌，它通過與破骨細胞表 面的RANK蛋白（S卩RANKL的受體)相互作用進而調節破骨細胞的分化成熟。同時，成骨細胞 還會分泌骨保護素蛋白（0PG)，它通過與RANK蛋白競爭結合RANKL，從而起到抑制破骨細胞 分化成熟的作用。一系列研究已經充分表明，RANKL/RANK/0PG信號體系在成骨細胞-破骨 細胞耦聯及骨骼代謝平衡中具有核心作用。
[0004]RANKL蛋白在體內存在兩種形式：全長RANKL及可溶性RANKL(solubleRANKL， sRANKL)。其中，小鼠RANKL蛋白全長316個氨基酸，人RANKL蛋白全長317個氨基酸，兩者 同源性達84%。而sRANKL則是分泌至細胞外的RANKL，它由一系列的蛋白酶如TACE、ADAM10 和MMP-14等對全長RANKL進行剪切得到，剪切位點在小鼠RANKL的139Phe，在人RANKL的 140Ile。RANKL蛋白具有典型的TNF結構域，與TNFalpha、CD401igand、Apo2L(TRAIL)及 Fasligand(FasL)等同屬TNF家族。此外，全長RANKL還包括莖狀結構區、一段短片段的疏 水性跨膜區和位于RANKL氨基端1-48的低復雜性氨基酸序列。TNF結構域是RANKL-RANK及 RANKL-0PG的相互作用區，是調控破骨細胞分化成熟的關鍵部位；225Glu、222Arg、299Asp 氨基酸對于RANKL-RANK的相互作用是關鍵的。由于小鼠RANKL蛋白與人源RANKL蛋白的 同源性較高，因此人們通常以小鼠RANKL蛋白做為研究對象，來進一步研究人RANKL蛋白的 相關生理生化特征。

【發明內容】

[0005] 為此，本發明所要解決的問題在于提供一種小鼠RANKL突變體表達載體以及表達 系統，進而便于更準確的對小鼠RANKL蛋白進行深入的研究。
[0006] 為解決上述技術問題，本發明提供了一種表達載體，所述表達載體為帶有FLAG標 簽的含有如SEQ·IDN0:16、SEQ·IDN0:17、SEQ·IDN0:18、SEQ·IDN0:19、SEQ·IDN0:20、SEQ· IDN0 :21、SEQ.IDN0 :22、SEQ.IDN0 :23、SEQ.IDN0 :24、SEQ.IDN0 :25、SEQ.IDN0 :26、SEQ.ID NO:27、SEQ.IDNO:28、SEQ.IDNO:29或SEQ.IDNO:30所示核苷酸序列的小鼠RANKL突變體基 因的載體。其中，所述小鼠RANKL突變體，其氨基酸序列如SEQ.IDNO:1、SEQ.IDNO:2、SEQ.IDN0 :3、SEQ.IDNO:4、SEQ.IDN0 :5、SEQ.IDN0 :6、SEQ.IDN0 :7、SEQ.IDN0 :8、SEQ.IDN0 :9、 SEQ.IDNO: 10、SEQ.IDNO: 11、SEQ.IDNO: 12、SEQ.IDNO: 13、SEQ.IDNO:14 或SEQ.IDNO:15 中任一所示。FLAG標簽系統是公認的用于表達、純化以及檢測融合蛋白的表達系統，廣泛應 用于Westernblotting、免疫細胞組化、免疫共沉淀、流式細胞術、蛋白純化以及蛋白相互 作用、蛋白分離等多個研究領域。FLAG標簽是專為標記目的而設計的多肽標簽，由8個親水 氨基酸殘基組成（DYKDDDDK)，因此不會占據其他表位與結合域，避免導致融合蛋白的功能、 分泌性以及轉運發生改變。由于它的親水性特點，FLAG標簽傾向于定位在融合蛋白表面， 因此更易與抗體結合以及被腸激酶酶解。有兩種商品化的抗體Ml和M2可特異性識別FLAG 標簽，其中Ml克隆的FLAG抗體可用于檢測FLAG標簽位于N末端的重組蛋白，而M2克隆的 FLAG單克隆抗體則可以檢測幾乎所有的FLAG標簽蛋白。
[0007] 所述表達載體是通過將編碼上述小鼠RANKL突變體的基因克隆至pFLAG-Cl載體 中的MCS區域獲得的。
[0008] 在所述的表達載體中，所述pFLAG-Cl載體是以pCMV-N-Flag和pEGFP-Cl為出發 載體通過基因重組獲得的。
[0009] 本發明提供了一種構建上述的表達載體的方法，包括使用限制性內切酶NheI和 BglII雙酶切質粒pCMV-N-Flag和pEGFP-Cl，進行基因重組操作的步驟，將pCMV-N-Flag載 體中的FLAG標簽替換至pEGFP-Cl載體的EGFP標簽位置，且pEGFP-Cl載體的EGFP標簽被 完全替換掉。
[0010] 本發明提供了一種含有所述的表達載體的重組細胞，所述重組細胞為由上述的表 達載體轉染的HEK293細胞。HEK293細胞株來源于人胚腎上皮細胞，其極少表達細胞外配體 所需的內生受體，由于容易轉染且容易培養，常被用于轉染試驗，是一個很常用的表達研究 外源基因的細胞株。
[0011] 本發明提供了一種構建上述重組細胞的方法，取上述的表達載體轉染入HEK293 細胞株中，經過抗性篩選，即得表達帶有FLAG標簽的小鼠RANKL突變體的細胞。
[0012] 本發明提供了一種所述的重組細胞在細胞染色、免疫印跡和免疫沉淀試驗中的應 用。
[0013] 本發明提供了一種重組細胞表達系統，所述表達系統為分別將上述的各個表達載 體轉染入細胞得到的細胞總和。
[0014] 本發明提供了一種所述的表達系統在細胞染色、免疫印跡和免疫沉淀試驗中的應 用。
[0015] 本發明的上述技術方案相比現有技術具有以下優點：
[0016] (1)本發明所述的含有編碼FLAG標簽的小鼠RANKL突變體的基因的表達載體，所 述表達載體表達了一種帶有FLAG標簽的小鼠RANKL蛋白中位于不同位點的半胱氨酸（Cys) 位點選擇性突變為甘氨酸（Gly)的小鼠RANKL突變體，從而可以更加準確的、方便的、高效 的對小鼠RANKL蛋白進行深入的研究；
[0017] (2)本發明所述的小鼠RANKL突變體的表達載體的構建方法步驟簡單易于操作， 所用時間短，通過該方法可以快速的獲得小鼠RANKL突變體的表達載體；
[0018](3)本發明所述的表達帶有FLAG標簽的小鼠RANKL突變體的重組細胞制備方法， 通過采用該方法獲得的重組細胞可以穩定的表達帶有FLAG標簽的小鼠RANKL突變體，進而 方便的研究小鼠RANKL蛋白相關生理生化特征；
[0019] (4)本發明表達帶有FLAG標簽的小鼠RANKL突變體的重組細胞可表達產生小鼠全 長RANKL及小鼠可溶性RANKL蛋白，且小鼠全長RANKL的N端融合了 FLAG標簽，可被FLAG 抗體特異檢測到，進而可以應用于細胞染色、免疫印跡、免疫沉淀等試驗，從而可以方便、高 效的研究Cys位點突變對小鼠RANKL蛋白相關生理生化特征的影響；
[0020] (5)本發明所述的表達帶有FLAG標簽的小鼠RANKL突變體的表達系統，該系統為 具有生物活性的、帶有FLAG標簽、不同半胱氨酸位點（Cys)突變了的小鼠核因子κΒ受體活 化因子配基（RANKL)的表達系統，通過該系統可以研究不同Cys位點突變對小鼠RANKL蛋 白相關生理生化特征的影響。
【附圖說明】
[0021] 為了使本發明的內容更容易被清楚的理解，下面根據本發明的具體實施例并結合 附圖，對本發明作進一步詳細的說明，其中
[0022] 圖1為實施例1的PCR克隆獲得小鼠RANKL基因片段的電泳結果；
[0023] 圖2為實施例1的重組pEGFP-RANKL載體的限制性內切酶鑒定結果；
[0024] 圖3為實施例2的使用多位點定點突變方法獲得的8種小鼠RANKL突變體的表達 載體的限制性內切酶鑒定結果；
[0025]圖4為實施例2的使用單位點定點突變方法獲得的7種小鼠RANKL突變體的表達 載體的限制性內切酶鑒定結果；
[0026] 圖5為實施例3中質粒pCMV-N-Flag和pEGFP-Cl的酶切產物的1%瓊脂糖凝膠電 泳結果；
[0027] 圖6為實施例3中質粒pFLAG-Cl的酶切產物的1%瓊脂糖凝膠電泳結果；
[0028] 圖7為實施例3中制備的小鼠RANKL突變體的表達載體的酶切產物的1%瓊脂糖 凝膠電泳結果；
[0029] 圖8為實施例4中制備的表達FLAG標簽及不同Cys位點突變小鼠RANKL突變體 的重組細胞的WesternBlotting鑒定結果；
[0030] 圖9為實施例5中表達FLAG標簽及不同Cys位點突變的小鼠RANKL突變體的重 組細胞的棕櫚酰化檢測結果。
【具體實施方式】
[0031] 本發明的下述實施例中所用的試劑、載體、蛋白、細胞等均為市售產品，不同廠家、 不同型號的下述試劑、載體、蛋白、細胞均可實現本發明的目的，效果并無明顯差異，本發明 的下述各實施例僅以如下型號和生產廠家的試劑、載體、蛋白、細胞為代表，進行技術效果 的闡述，并不局限于以下所列舉的型號和生產廠家的試劑、載體、蛋白和細胞。
[0032] 質粒抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、核酸純化試劑盒均購自上海生工生物 工程有限公司；
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