一種外源基因敲入乳酸乳球菌快速篩選系統及其構建方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬生物技術，具體說是將一個外源基因克隆到乳酸乳球菌（Lactococcus lactis，L. lactis)染色體上的新方法，該方法利用lacZ基因的表型特征，使篩選外源基因 敲入株更加方便快捷。
【背景技術】
[0002] 乳酸乳球菌（Lactococcus lactis，L. Lactis)是一種非侵入性、非致病性的食品 安全級革蘭陽性球菌，傳統上被用于多種食品（例如奶酪、黃油等）的生產之中。由于其重 要的應用價值，從20世紀80年代開始，乳酸乳球菌得到廣泛而深入的研究，其生化、免疫 以及遺傳背景已研究得比較清楚。由于其良好的安全性，乳酸乳球菌被廣泛用于表達各種 外源蛋白，包括各種酶、治療性蛋白產品和疫苗組分，應用于食品工業、生物制藥和疫苗研 制等領域，具有重要的經濟價值。其中，乳酸乳球菌乳脂亞種（L. lactis subsp. cremoris) MG1363和NZ9000,應用得最為廣泛。MG1363菌株具有生長迅速、遺傳操作簡便、外源基因導 入穩定等特點，并有大量的遺傳學工具。NZ9000是MG1363的衍生菌株，是在MG1363的p印N 基因中插入了 nisRK基因。該基因的產物能在微量的食品安全級抗菌肽nisin的誘導下， 增強PnisZ啟動子下游基因的過表達，蛋白表達量可達到生產級。因此，NZ9000被當做"細 菌工廠"，用于生產多種多樣的異源蛋白。由于乳酸乳球菌具有一般安全級（GRAS)性質，同 時它不屬于正常菌群，只在消化道內短期定植，因此NZ9000特別適于作為載體表達異源蛋 白，可直接用于人或動物的消化道。
[0003]在乳酸乳球菌中表達外源蛋白，可將目的基因克隆到質粒或者細菌染色體上兩個 方式，其中克隆到染色體上的方式更適宜，因為外源基因更為穩定，且不引入耐藥基因。克 隆的方式通常采用同源重組敲入（knock in)，需要在質粒上構建針對敲入位點的兩個同源 臂，而目的基因則位于上下游同源臂之間。敲入過程有兩個步驟：首先將質粒轉入乳酸乳球 菌，通過單交換同源重組，整個質粒整合到細菌基因組敲入位點，整合子通過質粒的耐藥標 記被篩選出來。然后將整合子在不含抗生素的培養基中傳代，此時部分細菌會發生雙交換 同源重組，整合的質粒被切離，同時質粒上的外源基因取代敲入位點序列，完成外源基因在 染色體上的克隆。對雙交換同源重組的篩選，一般是以質粒攜帶的耐藥標志存在與否來進 行初步判斷，即挑選大量傳代細菌克隆，檢測其是否仍具有耐藥性，失去耐藥性的克隆即為 發生了雙交換同源重組的克隆；進一步檢測該克隆的基因組上是否存在目的基因。由于雙 交換同源重組是一個小概率事件，往往要挑選成千上萬個克隆才能篩選到目的菌株，工作 量非常大，費時費力。

【發明內容】

[0004] 為了能夠簡化篩選步驟，本發明的目的是提供一種可以通過直觀觀察的篩選標 記，最大程度地減少篩選工作量的篩選系統。為了達到這個目的，發明人在乳酸乳球菌染色 體上敲入了一個lacZ基因，將其作為敲入位點，由于lacZ基因的編碼產物是半乳糖苷酶， 可分解X-Gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-3-D半乳糖苷）產生藍色產物，使菌落在含有X-Gal 的固體培養基上呈藍色。而如果lacZ基因被敲入的外源基因取代，該藍色表型則消失，菌 落呈白色。這種藍-白色的變化，可以在培養固體培養基上直觀地觀察到，因此大大減少篩 選的工作量和時間，簡化克隆步驟。
[0005] 本發明的技術方案是：
[0006] 為實現上述目的，本發明提供如下的技術方案：
[0007] -種外源基因敲入乳酸乳球菌的快速篩選系統，所述篩選系統包括溫敏質粒和乳 酸乳球菌；其中，所述溫敏質粒包含his基因片段和溫敏復制子-紅霉素抗性基因（Ts-Enf) 片段；所述乳酸乳球菌的染色體上包含lacZ基因表達片段；優選地，所述his基因片段的 序列為SEQ ID N0:2;更優選地，所述溫敏復制子-紅霉素抗性基因（Ts-EnO片段的序列 為SEQ ID N0 :5;尤其優選地，所述lacZ基因表達片段的核苷酸序列為SEQ ID N0 :12。
[0008] 在根據本發明的一個實施方案中，所述溫敏質粒是以pUC18質粒為骨架質粒構建 的。
[0009] 在根據本發明的一個實施方案中，所述溫敏質粒的核苷酸序列為SEQ ID N0 :1。
[0010] 本發明還提供了上述篩選系統的構建方法，所述方法包括：
[0011] 1)提供骨架質粒，將his基因片段和溫敏復制子-紅霉素抗性基因（Ts-Enf)片段 連接到所述骨架質粒中得到溫敏質粒；優選地，所述骨架質粒為PUC18質粒；
[0012] 2)將lacZ基因的表達片段通過同源重組的方法導入到乳酸乳球菌染色體上得到 染色體上含有lacZ基因的表達片段的乳酸乳球菌；
[0013] 優選地，所述his基因片段的序列為SEQIDN0 :2;更優選地，所述溫敏復制子-紅 霉素抗性基因（Ts-Enf)片段的序列為SEQIDN0 :5;尤其優選地，所述lacZ基因表達片段 的核苷酸序列為SEQIDN0 :12。
[0014] 在根據本發明的一個實施方案中，步驟1)所述的溫敏質粒是通過包括下述步驟 的方法實現的：
[0015] a)以序列為SEQIDN0 :18的引物HisF和序列為SEQIDN0 :19的引物HisR擴 增乳酸乳球菌NZ9000的his基因，將獲得的基因序列克隆到骨架質粒中；
[0016] b)以序列為SEQIDN0:20的引物TsF和序列為SEQIDN0:21的引物TsR擴增 質粒pCrePA2的Ts-Enf片段，并將獲得的Ts-Em1'片段克隆到經步驟1)處理的骨架質粒中；
[0017] c)經氨芐青霉素抗性篩選，取陽性克隆提取，即得溫敏質粒。
[0018] 在根據本發明的一個實施方案中，步驟a)中將所述his基因序列克隆到pUC18質 粒的EcoRI-Smal酶切位點。
[0019] 在根據本發明的一個實施方案中，步驟b)中將所述Ts-Enf片段克隆到pUC18質 粒的BamHI-PstI酶切位點。
[0020] 在根據本發明的一個實施方案中，步驟2)所述的染色體上含有lacZ基因的表達 片段的乳酸乳球菌是通過包括下述步驟的方法實現的：
[0021] d)合成序列為SEQ ID N0:6的啟動子？^，以序列為SEQ ID N0:22的引物PZF 和序列為SEQ ID NO :23的引物PZR擴增PnisZ，獲得Pnis^擴增產物；同時以序列為SEQ ID NO :24的引物LF和序列為SEQ ID NO :25的引物LR擴增lacZ基因，獲得lacZ基因的擴增 產物；
[0022] e)將步驟d)得到的PnisZ的擴增產物與lacZ基因的擴增產物等比例混合作為模 板，然后以PZF和LR為引物擴增，獲得序列為SEQ ID N0 :9的PZL片段；
[0023] f)將步驟e)得到的PZL片段插入序列為SEQ ID N0:10的pMG36e質粒的 EcoRI-Xbal位點，通過紅霉素抗性LB固體培養基篩選陽性克隆，酶切鑒定后提取得到質粒 pMG36e-PZL ；
[0024] g)以pMG36e-PZL質粒為模板，序列為SEQ ID N0:22的PZRec和序列為SEQ ID NO :22的TerRec為引物，擴增得到序列為SEQ ID NO :11的PZLT片段，然后將所述PZLT片 段克隆入線性化PJW質粒的AscI位點中，通過氨芐青霉素抗性固體培養基篩選陽性克隆， 經酶切、測序鑒定后，提取得到序列為SEQ ID N0 :11的pJW-PZLT質粒；
[0025] h)將步驟g)得到的pJW-PZLT質粒轉化受體菌NZ9000,然后先將獲得的細菌在紅 霉素抗性培養基Ml7GS中以38. 5 °C的高溫培養，再在無抗性Ml7GS培養基中以25 °C的低溫 培養，之后將低溫培養得到的培養液經適當稀釋后涂布于無抗性的含有40 μ g/mL的X-Gal 和0. 1 μ g/mL的nisin的M17GS固體培養基上，然后對獲得的藍色菌落進行紅霉素抗性篩 選；篩選到的無紅霉素抗性藍色克隆經鑒定即得到PZLT片段敲入株PZLTNZ。
[0026] 本發明進一步提供了上述篩選系統在快速篩選敲入乳酸乳球菌的外源基因中的 應用，其特征在于，所述應用為：將外源基因插入到所述溫敏質粒的his基因片段的中間， 使his基因片段在外源基因兩側形成同源臂，獲得含有外源基因的溫敏質粒；然后將所述 含有外源基因的溫敏質粒轉化到染色體上包含lacZ基因表達片段的乳酸乳球菌中，誘導 同源重組；以含有X-Gal的培養基進行篩選，其中白色菌落即是成功敲入外源基因的乳酸 乳球菌的菌落。
[0027] 在根據本發明的一個實施方案中，所述外源基因為序列為SEQIDN0:14的SACNP 基因。
[0028] 由于采用了上述技術方案，本發明具有如下的優點：
[0029]目前將外源基因克隆到乳酸乳球菌染色體上的方法，存在篩選工作量大，費時費 力，效率低下的問題。本發明針對這個問題，提供了一種利用菌落顏色的變化來快速篩選出 陽性克隆的快速篩選系統。本發明通過在乳酸乳球菌的染色體上插入了一個lacZ基因，將 其作為敲入位點，由于lacZ基因的編碼產物是半乳糖苷酶，可分解X-Gal產生藍色產物，使 菌落在含有X-Gal的平板上呈藍色。而如果lacZ基因被敲入的外源基因取代，該藍色表型 則消失，菌落呈白色。這種藍-白色的變化，可以在培養平板上直觀地觀察到，因此大大減 少篩選的工作量和時間。
【附圖說明】
[0030] 圖1為溫敏質粒PJW的圖譜及其構建。其中his為乳酸乳球菌NZ9000的his (組 氨酸合成酶）基因，用作同源重組雙交換的左右臂；Ts Ori為來自pCrePA2質粒的溫敏復 制子；〇ri為來自pUC18質粒的復制子;MCS為多克隆位點；Enf為紅霉素抗性基因；Ap"為氨 芐青霉素抗性基因；P(Enf)為紅霉素抗性基因啟動子；PApD為氨芐青霉素抗性基因啟動 子。〇
[0031] 圖2為lacZ基因表達片段PZLT敲入質粒pJW-PZLT的構建。其中his為乳酸乳球 菌NZ9000的his (組氨酸合成酶）基因，用作同源重組雙交換的左右臂；Hisa和Hisb，his 基因經AscI酶切后的兩個片段，作為同源重組雙交換的左右臂；Ts Ori為來自pCrePA2質 粒的溫敏復制子；Ori為來自pUC18質粒的復制子；Ori o