表達豬細小病毒vp2蛋白的重組載體、重組菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術領域，具體涉及表達豬細小病毒VP2蛋白的重組載體、重組菌及其應用。
【背景技術】
[0002]豬細小病毒(porcine parvovirus, PPV)是引起母豬繁殖障礙的主要病原之一，尤其是初產母豬在沒有免疫的條件下發病更為嚴重，以死胎、木乃伊胎、死產、母豬流產、延期發情和產弱仔為主要特征。1967年Cartwright首次分離出PPV后，該病毒在世界范圍內廣泛傳播和流行。上世紀80年代我國改革開放以后，隨著規模化豬場逐漸增多，PPV在我國的感染越發嚴重，陽性檢出率達90%以上，給我國的養豬產業帶來了巨大的經濟損失。PPV屬于細小病毒科，細小病毒屬，PPV基因組編碼有3種結構蛋:VP1、VP2和VP3，3種非結構蛋白:NS1、NS2和NS3。其中VP2蛋白是構成PPV病毒衣殼的主要結構蛋白，且是最重要的免疫保護性抗原。
[0003]許多研究和臨床實踐表明疫苗免疫是控制PPV流行的一個很有效的方法。豬體免疫后，主要通過產生體液免疫應答來獲得抵抗PPV感染的保護力。我國用于預防PPV的疫苗主要為滅活疫苗，即將PPV在ST細胞等豬源傳代細細胞系上進行培養，分離去除細胞雜質獲得具有感染性病毒，之后用化學試劑滅活、佐劑混合制成疫苗。PPV滅活疫苗具有安全性好、不需要低溫保存等優點。但滅活疫苗也存在著生產成本昂貴、生產耗時長、需要大量勞動力、且免疫效果不穩定的缺點；另外，滅活的化學試劑和殘留病毒DNA可能對免疫豬體存在危險性。新型PPV亞單位疫苗獲得了廣泛的研究，VP2在體外表達后不僅具有良好的免疫原性，而且可以誘導產生強烈免疫保護性。目前用于研究豬細小病毒亞單位疫苗抗原的表達系統主要是桿狀病毒感染的昆蟲細胞表達系統，其表達蛋白具有高可溶性和血凝性，能產生病毒樣顆粒，免疫保護效果較好，但其生產成本比PPV滅活疫苗高出數倍，在生產操作方面更為復雜，對人員素質要求更高。通常情況下，原核表達系統相比較于真核系統，蛋白表達量高、生產成本低，生產操作更為簡單，對人員素質要求也更低，但是現有技術中，采用原核表達系統制備的VP2蛋白為不具有可溶性和血凝性的包涵體，免疫原性較差，免疫后免疫指標不好用通用HI試驗進行評定。

【發明內容】

[0004]本發明目的是提供表達豬細小病毒VP2蛋白的重組載體，將該重組載體導入大腸桿菌后，能夠可溶性表達VP2蛋白，該VP2蛋白具有血凝性和優異的抗原性。
[0005]本發明的另一目的是提供制備豬細小病毒VP2蛋白的重組菌，能夠可溶性表達VP2蛋白，該VP2蛋白具有血凝性和優異的抗原性，可以用于制備豬細小病毒疫苗。
[0006]本發明的再一目的是提供制備豬細小病毒VP2蛋白的方法，該方法能夠高效制備VP2蛋白、生產成本低、操作簡單，不操作豬細小病毒具有更好的生物安全性。從實際操作性考慮，有望代替滅活疫苗制苗用抗原。
[0007]本發明的目的采用如下技術方案實現。
[0008]表達豬細小病毒VP2蛋白的重組載體，是將豬細小病毒VP2蛋白編碼基因插入原核表達載體pEASY-blunt El后得到。
[0009]在本發明中，所述豬細小病毒VP2蛋白編碼基因來源于豬細小病毒PPV-JS株。
[0010]本發明還提供表達豬細小病毒VP2蛋白的重組菌，是將所述重組載體導入大腸桿菌后獲得。
[0011]所述大腸桿菌為BL-21。
[0012]本發明還提供所述重組菌在制備豬細小病毒VP2蛋白方面的應用。
[0013]在本發明中，所述應用包括誘導所述重組菌表達豬細小病毒VP2蛋白的步驟。
[0014]優選的技術方案在，在重組菌培養物0D600達到0.4-0.6時，采用IPTG誘導表達豬細小病毒VP2蛋白。
[0015]優選的技術方案中，IPTG添加至重組菌培養物中的終濃度為0.05-0.2mM。
[0016]本發明表達豬細小病毒VP2蛋白的重組載體，導入大腸桿菌后，能夠可溶性表達VP2蛋白，該VP2蛋白具有血凝性和優異的抗原性，有望應用于制備豬細小病毒疫苗。采用本發明重組菌能夠高效制備豬細小病毒VP2蛋白，生產成本低、操作簡單、不操作豬細小病毒具有更好的生物安全性。
【附圖說明】
[0017]圖1顯示了 VP2蛋白編碼基因的擴增結果，其中泳道M為DL 2 000 Marker，其余泳道為PCR擴增產物。
[0018]圖2顯示了重組質粒P-PPV-VP2的雙酶切鑒定結果，其中泳道M為DL 2 000Marker，泳道I為陽性重組質粒p_PPV_VP2。
[0019]圖3顯示了 VP2蛋白在BL-21-VP2和對照菌BL-21-p中的表達情況。Marker:Thermo Scientific PageRuler 預染Ladder ；1:對照菌BL_21_p裂解液上清；2:BL_21_VP2裂解液上清；3:對照菌BL-21-p裂解液沉淀；4:BL-21-VP2裂解液沉淀。
[0020]
圖4是各樣品血凝性檢測結果，每行左邊顯示了孔的編號，每行樣品從左往右濃度依次降低。
[0021]圖5顯示了 0D600為0.4、0.5和0.6時誘導后，菌體裂解液上清的血凝性檢測結果，其中最左邊的標記表明每行樣品誘導前的0D600值，右邊給出每行樣品的血凝效價。
[0022]圖6.采用PPV-JS或BL-21-VP2的4單位抗原檢測待檢血清的HI抗體效價結果，其中左邊的文字指出每行檢測的血清，右邊的文字指出孔的編號。
【具體實施方式】
[0023]實施例1構建表達VP2蛋白的重組菌一構建重組表達載體
1.引物設計
參照PPV- NADL2株基因序列(KF049424.1)，應用Primer premier 5.0軟件設計引物PPV-VP2-kpn i和PPV-VP2_bamh i，用于擴增豬細小病毒PPV-JS株(縮寫為PPV-JS株，公開于CN102965345A，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏號為CGMCCN0.6605) VP2蛋白編碼基因全部序列。
[0024]PPV-VP2-kpn i 的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)如下:ggtaccATGAGTGMMTGTGGMCMG，PPV-VP2-bamh i 的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)如下:ggatccCTAGTATMTTTTCTTGGTAT，由上海英駿生物有限公司合成。其中PPV-VP2-kpn i攜帶Kpn I酶切位點，PPV-VP2_bamh i攜帶Bamh I酶切位點。
[0025]2.PPV-JS株基因組DNA的提取
(1)取PPV-JS株病毒樣品450μ I加入50 μ 1、濃度為10%的SDS溶液，加入3 μ I蛋白酶K ;
(2)在56°C水浴中震蕩條件下孵育30min;
(3)加入500μ I的TRIS-酚，混勻，5分鐘后，在4°C、10000-12000r/min條件下離心10分鐘；
(4)取上清，加入1:1(V/V)混合的TRIS-酚和氯仿混合物500 μ 1，作用5分鐘后10000-12000r/min 離心 10 分鐘；
(6)取上清，加入500μ I的氯仿，作用5分鐘，10000-12000r/min離心10分鐘；
(7)取上清，加上清體積2倍的無水乙醇和10%(體積百分濃度)的醋酸鈉水溶液；
(8)將步驟(7)所得混合物置于_20°C下30分鐘以上；
(9)取_20°C下放置的樣品在4°C、10000r/min離心10分鐘；
(10)棄上清，在沉淀中加入75%(體積百分濃度)的乙醇水溶液，在4°C、6500r/min離心5分鐘，棄去上清；重復2遍；
(11)吸干或者晾干乙醇；
(12)加入30μ I的ddH20溶解，得到PPV-JS株基因組DNA，置于_20°C下保存。
[0026]3.VP2蛋白編碼基因的擴增和純化回收
(I)將反應體系設定為50 yL體系:0.5 μ L PrimerSTAR高保真酶，10 μ L 5XPSBuffer, 4 μ L dNTPs，引物 PPV_VP2_kpn i 和 PPV-VP2_bamh i各 I yL(20 ymol/L),2 yLPPV-JS 株基因組 DNA, 28.5 μ L ddH20。
[0027](2)反應條件:98°C 2min ；98°C 15s，60°C 30 s，72 °C 2min，30 個循環；72°C5min。產物在4°C保存。
[0028](3)采用1%瓊脂糖凝膠電泳回收擴增的基因片段，以DL 2 000 Marker作為對照。結果如圖1所示，在大約1.7kb處出現特異性的VP2蛋白編碼基因條帶。采用OMEGA DNA凝膠回收試劑盒回收VP2蛋白編碼基因。具體操作見說明書。
[0029]豬細小病毒PPV-JS株VP2蛋白編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0030]PCR過程中用到的試劑購自TAKARA。
[0031]4.表達質粒的構建
(I)將VP2蛋白編碼基因插入pEASY-blunt El原核表達載體(購自北京全式金生物技術有限公司)，構建重組質粒P-PPV-VP2。連接體系為5yL體系:2yL VP2蛋白編碼基因膠回收產物，I μ L pEASY-blunt El 載體，2 μ L ddH20。24°C連接 20min。
[0032](2)將連接產物加入到100 μ L的DH5a感受態細胞中，冰浴30 min，之后42°C熱休克90 S，冰浴5 min。加入ImL LB培養基，37°C搖床上180 rpm培養I h，取出后1000g離心I min，棄800 μ L上清，留200 μ L上清重懸菌體，全部涂布具有氨芐(Amp)抗性的LB平板上，37 °C培養過夜。
[0033](3)隨機挑取上述LB平板上的單菌落，接種于具有氨芐抗性的LB液體培養基中，37 °C過夜培養。
[0034]5.質粒的提取
采用鼎國質粒小量提取試劑盒提取本實施例步驟4中挑選到的重組菌內的質粒，具體操作步驟見試劑盒說明書。
[0035]6.重組質粒的鑒定
10 μ L 雙酶切鑒定體系:0.5 yL BamH I，0.5 μ L Kpn I，I μ L 1XK Buffer, 4 μ L質粒，4yL ddH20，37°C酶切I h。酶切產物的電泳圖如圖2所示，質粒經BamH I和Kpn I酶切鑒定正確，為陽性重組質粒，命名為P-PPV-VP2。將重組質粒P-PPV-VP2送英駿公司測序，測序正確。
[0036]二構建重組菌
1.重組質粒