一種豬瘟病毒基因重組腺病毒及其生產方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于病毒疫苗制備技術領域，具體涉及一種豬瘟病毒基因重組腺病毒及其 生產方法。
【背景技術】
[0002] 豬痕（CSF)是由豬痕病毒（Classicalswinefevervirμs，CSFV)引起的一種 豬的高度接觸性傳染病，死亡率極高，給世界養豬業造成了巨大的經濟損失。豬瘟已被世界 動物衛生組織（0ΙΕ)列為家畜Α類傳染病，我國也將其列為一類動物疫病。臨床以稽留高 燒、皮膚和黏膜出現大量出血點為特征。多年的實踐經驗證明，疫苗接種是預防和控制動物 疫病的主要手段。20世紀60年代，我國研制出經人工誘變獲得的豬瘟兔化弱毒株（又稱C 株）疫苗在CSFV防控中起到了決定性作用，有效的控制了豬瘟在我國乃至世界范圍內大規 模的流行。豬瘟C株弱毒疫苗是目前國內外廣泛使用的疫苗，其安全性和免疫效力已被社 會認可。但其受母源抗體干擾，導致免疫失敗的現象時有報道，接種此弱毒疫苗產生的抗體 無法與野毒感染產生的抗體相區分，給免疫的制訂和國家豬瘟防控凈化也帶來了巨大的挑 戰，制約著我國生豬及豬肉制品在非免疫國家和地區的貿易發展。
[0003]目前廣泛使用的豬瘟疫苗（豬瘟脾淋苗、豬瘟乳兔苗）都需要用活體動物生產，組 織毒生產工藝繁瑣，人員工作量大，疫苗生產廠家能否嚴格做到使用未曾接種過兔瘟疫苗 的兔子來做疫苗，也是一個值得懷疑的問題。隨著生物安全、動物福利越來越被人們重視， 國際上不再提倡用活體動物組織制備疫苗。以活病毒表達載體為基礎的基因工程載體疫苗 的研制是當今病毒病防治與發明的熱點之一。腺病毒具有應用方便、表達效率高、使用安全 及重組病毒遺傳特性穩定等特點，受到了各國學者的重視，目前已應用于新型減毒活疫苗 和基因治療的發明中。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的是提供一種豬瘟病毒基因重組腺病毒及其生產方法，從而彌補現有 技術的不足。
[0005] 本發明首先提供一種能用于制備豬瘟病毒基因重組腺病毒的基因片段，其氨基酸 序列為SEQIDN0:2,其一種編碼的核苷酸序列為SEQIDNO: 1 ;
[0006] 本發明還提供一種豬瘟病毒基因重組腺病毒，是將上述的基因片段同源重組到人 5型復制缺陷型腺病毒基因組的多克隆位點制備的。
[0007] 本發明制備的豬瘟病毒基因重組腺病毒用于制備疫苗；
[0008] 本發明另一方面提供了一種豬瘟病毒基因重組腺病毒疫苗的生產方法，具體是利 用貼壁培養HEK293細胞生產豬瘟病毒基因重組腺病毒。
[0009] 上述方法的一種具體操作如下：用20%濃度的W-DMEM培養基復蘇HEK293細胞， 在復蘇48h后，用10%濃度的W-DMEM培養基進行HEK293細胞的擴大培養，培養24h后接 種上述的重組腺病毒，感染48h后收獲到高病毒滴度的病毒，再制備成疫苗。
【附圖說明】
[0010] 圖1 :不同培養基下HEK293細胞的生長曲線圖，
[0011] 圖2 :不同儲存條件病毒滴度結果圖，
[0012] 圖3 :不同接毒比例病毒滴度結果圖；
[0013] 圖4 :不同收毒時間病毒滴度結果圖，
[0014] 圖5 :細胞病變與間接免疫熒光檢測圖（200X);其中，A:HEK293細胞病變；B:HEK 293正常細胞；C:rAd-E0-E2感染HEK293細胞IFA檢測；D:rAd-E0-E2未感染HEK293細 胞陰性對照。
【具體實施方式】
[0015] 申請人在豬瘟活疫苗的研究基礎上，利用人5型腺病毒基因組作為骨架構建了感 染性分子克隆，在其基因組的多克隆位點區插入所篩選出CSFV的基因抗原優勢區（共585 個氨基酸）。獲得的重組病毒在細胞上連續傳了 60代，插入的外源基因片段沒有發生任何 突變或丟失，而且通過免疫熒光檢測到外源基因穩定表達，提供的保護性相比于脾淋苗效 果更好，并且具有腺病毒特征性基因，能夠和疫苗毒與野毒感染相區分，同時能區分CSFV 和脾淋苗（包括野毒）。用該重組病毒制備的疫苗不但可以通過抗體鑒別技術區分疫苗免 疫動物和野毒感染動物，極大地促進CSFV的凈化或根除，可提高豬的存活率，增加豬的存 欄量和出欄量，對豬肉市場上相關畜產品的供應和穩定物價具有重要的意義。
[0016] 本發明通過不同培養基培養HEK293細胞，選擇最適宜HEK293細胞生長的培養 基；再用同代次不同儲存條件的病毒感染HEK293細胞、同病毒不同接毒比例感染細胞、同 病毒同比例感染細胞，不同收毒時間，比較病毒滴度IFU的大小。本發明利用貼壁培養HEK 293細胞生產豬瘟病毒基因重組腺病毒，進行了不同培養基、病毒不同儲存條件、不同接毒 比例、不同收毒時間摸索試驗。
[0017] 下面對本發明的一種豬瘟病毒基因重組腺病毒疫苗的HEK293細胞貼壁生產工藝 方法進行詳細的描述。
[0018] 實施例1 :豬瘟病毒E0-E2基因重組腺病毒的制備
[0019] 1. 1通過對豬瘟石門系強毒（CSFV)的基因組序列進行分析，得到了具有抗原性的 核苷酸片段，并對其序列進行改造，改造后的核苷酸序列為SEQIDN0:1，編碼的氨基酸序 列為SEQIDN0:2。上述片段制成的疫苗，相比于已報道的疫苗，其免疫性能更好。將改造后 的基因克隆入PET32a(+)多克隆酶切位點，轉化DH5a大腸桿菌，涂氨芐抗性平板，挑取單克 隆，測序鑒定。選擇測序正確的陽性菌落，挑取單克隆，測序鑒定。
[0020] 1. 2將目的基因定向克隆于穿梭質粒載體pAdTrack-CMV中，采用"兩步轉化法"在 細菌內同源重組，構建出攜帶目的基因的重組腺病毒轉移載體質粒pAdEasy-E02,經PacI 酶切線性化后轉染人胚胎腎細胞（HEK293)，成功包裝出豬瘟病毒目的基因的重組腺病毒。
[0021] 1. 3將此豬瘟病毒目的基因重組腺病毒頸部肌肉注射免疫3~5周齡斷奶健康仔 豬5頭，取5頭作為空白對照，分別于免后28日采集血清，檢測豬瘟病毒抗體水平，并對10 頭豬進行攻毒，攻毒前檢測豬瘟抗體水平，攻毒后采用PCR檢測方法檢測有無豬瘟病毒殘 留，以此來確定該疫苗的免疫和保護效果。經檢測結果如下表1，說明該重組腺病毒疫苗免 疫效果良好。
[0022] 表1豬瘟病毒目的基因重組腺病毒免疫豬28天抗體檢測結果
[0023]
[0024] 實施例2 :不同培養基HEK293細胞貼壁培養生長工藝
[0025] 2. 1HEK293細胞培養從液氮罐中取出3支同一批次HEK293凍存細胞，快速將其 放在37°C水浴中，輕輕搖晃，使之迅速融化。吸出溶有細胞的凍存液，分別加到事先裝有培 養液（37°C預熱，6~8mL)的離心管內，輕柔吹打混勾，1000g/min離心5min，棄上清，分別 加入 10mL含 20%血清（WeikeshengFBS、GibcoFBS、GibcoNCS)的DMEM培養基，輕柔吹 打成細胞懸液，分別于10mL培養瓶內，37°C、5% 0)2培養箱下培養。
[0026] 2. 2不同培養基的摸索復蘇細胞48h后換液1次，待細胞的融合度約90%時，用 PBS清洗一次，加入少許胰酶覆蓋細胞面，靜止消化lmin。分別加入10%(W、G、N)的培養 基，溫和吹打混勻，以2. 5X105/mL密度于24孔板，每種培養基分8組，每組3孔，37°C、5 % C〇2培養箱下培養，每24h計數一次，每次計3孔，連續計數8天，將所得數據以培養時間為 橫坐標，細胞數目為縱坐標繪制曲線，即可得到細胞生長曲線，觀察不同血清培養基條件下 細胞生長情況及其細胞數目。
[0027] 2. 3不同培養基HEK293細胞生長結果HEK293細胞的生長曲線可以看出（圖1)， 同一時間細胞計數，10%W-DMHM培養條件下的細胞數目比10%N-DMHM和10%G-DMHM培 養條件下的細胞數目均多，細胞活力、細胞生長狀態也優于后兩種培養基，因此，本次試驗 采用W-DMEM培養HEK293細胞。
[0028] 實施例3 :豬瘟病毒基因重組腺病毒不同儲存條件的工藝
[0029] 3. 1不同儲存條件操作方法細胞傳代24h后，當貼壁細胞匯合達70%~80%單層 細胞時，用1%培養基替換10%培養基。將重組腺病毒分別按1%、3%的比例感染HEK293 細胞，根據病變情況適時收毒。
[0030] 3. 2不同儲存條