專利名稱：具有t細胞輔助活性的肽類的制作方法
技術領域：
本發明一般涉及能夠刺激T細胞輔助活性的合成肽類。更具體地說，本發明的肽類是以胸脾素(thysplenin)分子為基礎的四肽和五肽。
現已分別從牛和人的胸腺和脾臟分離出了兩種免疫調節蛋白胸腺生成素和胸脾素(以前稱為“脾素”)。此外，用化學方法還合成了一些具有胸腺生成素生物活性的小肽·并進一步進行了修飾使其具有諸如對酶作用具有抗性等性質。參見例如美國專利4，505，853。
現已發表了大量有關這類蛋白和合成肽類的文章和專利。美國專利4，190，646公開了一種叫做胸腺五肽(thymopentin)的五肽·它是胸腺生成素的活性部位，其順序為Arg-Lys-Asp-Val-Tyr;該專利還公開了一些肽組合物，其中這個五肽的氨基末端和/或羧基末端被各種不同的基團取代。胸腺生成素和胸腺五肽都能在兩個人T細胞系，即CEM和MOLT-4中誘導生物學變化，從而表明它們具有刺激T細胞生物活性的作用。沒有發現任何比五肽(即5個氨基酸順序)短的胸腺五肽類似物對CEM細胞具有活性。
申請人的共同未決美國專利申請53186公開了一種自人脾分離的48個氨基酸的免疫調節蛋白脾素(以下稱作“胸脾素”)。牛胸脾素在小鼠體內能刺激T細胞輔助活性。因此預計人胸脾素在人體內具有類似的生物活性。上述專利申請敘述了人胸脾素在人T細胞系MOLT-4中能誘導細胞內cGMP升高。牛胸脾素的活性部位(稱為Sp-5)跨過該分子的32-36位氨基酸殘基，其順序為Arg-Lys-Glu-Val-Tyr。在56，186號申請中，所公開的人胸脾素活性部位的順序為Arg-Lys-Ala-Val-Tyr。
胸脾素不同于胸腺生成素，它不使CEM細胞的生物活性發生變化。因此胸脾素是刺激T細胞輔助活性，而不是刺激T細胞抑制活性。可參閱例如 Goldstein，G.Nature(London)24711-14(1974);Basch，R.S.and Goldstein，G.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，711474-1478(1974);Scheld，M.P.et al J.Exp.Med.，1471727-1743(1978);Scheid，M.P.et al Science，1901211-1213(1975);Ranges，G.E.et al，J.Exp.Med.，1561057-1064(1982);T.Audhya et al.，Biochem，206195-6200(1981);Venkatasubramanian，K.，et al，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，833171-3174(1986);Malaise M.G.et al，in "Immunoregulatory UCLA Symposium on Molecular and Cellular Biology"，eds.Goldstein，G.，et al (Liss，New York)(1986);Sunshine，G.H.et al，J.Immunol.，1201594-1599(1978);E.Rentz et al，Arch.Geschwulstforsch，54(2)113-118(1948)。還可參閱美國專利4，190，646;4，261，886;4，361，673;4，420，424;4，629，723。參考上述專利、申請和論文是為了討論本發明所涉及的其它背景材料和生物學過程。
1984年1月31日頒發的Kisfaludy等人的美國專利4，428，938，公開了某些影響免疫調節的肽，其中包括下列四肽
Arg-Lys-Asp-ValArg-Lys-Asn-ValArg-Lys-Ala-ValArg-Lys-Asp-AlaArg-Lys-Asp-IleArg-Lys-Glu-ValGlp-Arg-Lys-Asp4，428，938號專利一般包括這些順序的鹽、酰胺、低級烷基酯和被保護的衍生物，以及用這些順序治療由胸腺缺損造成的免疫失調癥的方法。在該專利中，用體外E玫瑰花試驗測試了這些肽的活性。
這些研究人員還在另一篇論文中報導了上述四肽(Kisfaludy et al，Hoppe-Seyler′s Z， Physiol，Chem.B.D.364，S.933-940，1983)。該文報導了Arg-Lys-Glu-Val順序是一種在體外E玫瑰花試驗中具有高度活性的類似物，而Arg-Ala-Asp-Val和Arg-Lys-Ala-Val順序的活性劇烈下降。
本領域內仍然需要另一些可用來刺激人的免疫系統的肽類，用于治療各種T細胞缺損癥。
本發明描述了一組在MOLT-4T細胞系中能夠誘導生物活性的胸脾素肽類似物。與以前報導的胸腺五肽類似物不同的是，與胸脾素有關的，長度短于5個氨基酸的肽類，與此處所述的胸脾素五肽類似物一樣，在MOLT-4細胞中具有誘導T細胞輔助活性的作用。
一方面，本發明涉及具有下式的新的四肽或其藥學上可接受的酸加成鹽或堿加成鹽
其中R為H、低級烷基、乙酰基、甲酰基、低級鏈烷酰基;
X為Pro、脫氫-Pro、羥基-Pro、D-Lys、α-甲基丙氨酸(Aib)或Lys;
Y為選自Ala、Asp、Glu、Gln、Asn、β-Asp、Val、Leu或Ile的D或L氨基酸;
Z為Gly或選自Val、Ala、Leu或Ile的D或L氨基酸;
R1為OH或NR2R3，其中R2和R3為H或含1至6個碳原子的直鏈或支鏈烷基或烯基，視需要可被一個芳基或帶有取代基的芳基取代，所述取代基或者是一個鹵素，或者是一個含1-6個碳原子的直鏈或支鏈烷基或烯基;或者，R2和R3一起構成一個有3至7個碳原子的環亞甲基;
條件是，當X為Lys，Z為Val時，Y不為Asp、Asn、Ala、Asu或Glu;當X為Lys時，Y不為Asp;當X為Ala，Z為Val時，Y不為Asp。
另一方面本發明涉及具有下式的新的五肽或其藥學上可接受的酸加成鹽或堿加成鹽，其特征是在人T細胞系MOLT-4中能夠增強cGMP活性。
其中R2為H、低級烷基、乙酰基、甲酰基、低級鏈、烷酰基或脫氨基;
X′為Pro、脫氫-Pro、羥基-Pro、D-Lys、Aib或Lys;
Y′為選自Val、Ile、Leu、Lys、Ala、Asp、Glu、Gln的D或L氨基酸;
Z′為選自Tyr、Val、Leu、His、Ala或Trp的D或L氨基酸;
R3為OH或NR4R5，其中R4和R5為H或一個含1-6個碳原子的直鏈或支鏈烷基或烯基，視需要可被一個芳基或帶取代基的芳基取代，所述取代基或者是一個鹵素、或者是一個含1至6個碳原子的直鏈或支鏈烷基或烯基;或者，R4和R5一起構成一個有3至7個碳原子的環亞甲基。
這些肽和含有這些肽的組合物令人驚奇地保留了人胸脾素的生物活性。這些肽中有許多還具有如下特征，即它們在消化道和血清中對內肽酶、外肽酶和胰蛋白酶樣酶作用的抗性增強。因此，這些肽治療免疫缺陷具有顯著優點。特別是，其中X或X′為Pro或Aib的目的四肽或五肽對諸如血清肽酶等酶的降解作用具有令人驚奇的抗性。
又一方面本發明包括含有這些肽的治療組合物和用這些肽治療各種需要免疫調節的病癥的方法。
下面詳細敘述包括優選實施方案的實例，公開本發明的其它方面和優點。


圖1是MOLT-4 cGMP測定的圖示，將肽濃度(μg/ml)對cGMP濃度(微微克/ml)作圖，其中比較了胸腺五肽(TP-5)和本發明肽相對于對照的活性。
圖2是MOLT-4 cGMP測定的圖示，將肽濃度(μg/ml)對cGMP濃度(微微克/ml)作圖，其中比較了胸腺五肽(TP-5)和本發明的一種肽Ac-Arg-Pro-Val-Ala-NH2的活性。
本發明提供一組具有下式的四肽或其藥學上可接受的酸加成鹽或堿加成鹽
其中，R、X、Y、Z和R1如上所限定，條件是，當X為Lys，Z為Val時，Y不為Asp、Asn、Ala、Asu或Glu;當X為Lys時，Y不為Asp;當X為Ala，Z為Val時，Y不為Asp。本發明還提供一組具有下式的五肽或其藥學上可接受的酸加成鹽或堿加成鹽，其特征是在MOLT-4細胞中能夠誘導活性。
其中R2、X′、Y′、Z′和R3如上所限定。
此處所用的術語“低級烷基”包括含1至6個碳原子的支鏈或直鏈飽和烴基，例如甲基、乙基。丙基、異丙基、戊基、己基等，而術語“低級鏈烷酰基”指低級烷基 為方便起見，在整個本公開中，肽的氨基酸成分和某些用于制備肽的物質用縮寫表示。多數用三字母縮寫的氨基酸是熟悉的。幾個不常見縮寫是Asu，代表氨基琥珀酰亞胺基;Glp，代表焦谷氨酰基(也寫作p-Glu)。除非另外指出，所有氨基酸都是L-異構體構型。如果有D-異構體構型，則將以“D-”標明。
本發明的某些優選的四肽是上述式I中X為Pro或Aib的四肽。更為優選的肽是式I中X為Pro，Y為Val，Z為Ala或X為Pro，Y為Ala，Z為Val的肽。一些優選的四肽為下列肽乙酰基-Arg-Pro-Val-Ala-NH2Arg-Pro-Asp-ValArg-Pro-Asp-Val-NH2甲酰基-Arg-Pro-Asp-Val乙酰基-Arg-Pro-Asp-Val乙酰基-Arg-Pro-Asp-Val-NH2乙酰基-Arg-Pro-Ala-Val-NH2乙酰基-Arg-Pro-D-β-Asp-Val-NH2乙酰基-Arg-Pro-Glu-Val-NH2乙酰基-Arg-Pro-Glu-Val乙酰基-Arg-Aib-Ala-Val-NH2乙酰基-Arg-Aib-Glu-Val-NH2乙酰基-Arg-Pro-β-Asp-Gly-NH2本發明的某些優選的五肽是式Ⅱ中X′為Pro或Aib的五肽。更為優選的肽是上式Ⅱ中X′為Pro，Y′為Val，Z′為Tyr的肽。更為優選的五肽是下列肽
Arg-Pro-Ala-Val-TyrArg-Pro-Ala-Val-Tyr-NH2乙酰基-Arg-Lys-Ala-Val-Tyr-NH2能與這些肽形成鹽的酸包括(但不限于)無機酸，例如鹽酸、氫溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸、磷酸等。也可以應用有機酸來形成本發明的鹽，例如可以應用甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、氨茴酸、肉桂酸、萘磺酸、磺胺酸等。
能與具有酸性基團的肽形成鹽的堿包括(但不限于)無機堿，例如氫氧化鈉、氫氧化銨、氫氧化鉀等。可作此用的有機堿包括(但不限于)單二和三烷基和芳基胺(例如三乙胺、二異丙胺、甲胺、二甲胺)及取代和未取代的乙醇胺(例如乙醇胺、二乙醇胺)。
本發明的肽一般可按照已知技術制備。可以方便地按固相合成法(Merrifield，J.A.C.S.852149-2154，1963)制備本發明的多肽。此技術是十分熟悉的制備肽的通用方法。固相合成法包括向以共價鍵結合在固體樹脂顆粒上的正在增長的肽鏈中，分步加入被保護的氨基酸。進行這一操作時，利用過濾可除去各種試劑和副產物，因而中間體無需純化。此方法的一般概念取決于該鏈的第一個氨基酸通過共價鍵與一種固體聚合物連接。以分步方式依次加入被保護的氨基酸，一次加入一種氨基酸或分批加入(in blocks)，直到所要的順序組合。最后，從固體樹脂載體上分離出被保護的肽，并脫去保護基。
氨基酸可以連接到任何適于作樹脂的聚合物上。該樹脂必須含有一個官能團，第一個被保護的氨基酸能以共價鍵牢固地連接在該官能團上。各種聚合物都適于此目的，例如纖維素、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸甲酯和聚苯乙烯。可用于這類合成的適當保護基包括叔丁氧羰基(BOC)、芐基(BZL)、叔戊氧羰基(AOC)、甲苯磺酰基(TOS)、鄰溴苯基甲氧羰基(BrZ)、2，6-二氯芐基(BZLCl2)和苯基甲氧羰基(Y或CBZ)在上述文獻及J.F.W.McOmie.“Protective Groups in Organic Chemistry”，Plenum Press，New York，1973中確定了另一些保護基。這兩本書在此都列為參考文獻。
制備本發明肽的一般步驟包括先使被保護的C末端氨基酸與樹脂連接。連接后濾出樹脂，洗滌，并脫去C末端氨基酸的α氨基上的保護基(最好是叔丁氧羰基)。當然，脫去這個保護基時，必須不斷裂該氨基酸和樹脂間的連鍵。然后在所得的樹脂肽上偶聯倒數第二個C末端被保護的氨基酸。進行這一偶聯時，在第二個氨基酸的游離羧基和連在樹脂上的第一個氨基酸的氨基之間形成一個酰胺鍵。用順序的氨基酸重復這一反應過程，直到所有氨基酸都連到樹脂上。最后，從樹脂上切落被保護的肽，脫去保護基，得到所要的肽。用來從樹脂中分離肽的切落技術和脫去保護基的技術，取決于選擇的樹脂和保護基，這些技術對熟悉肽合成領域的人來說是已知的。
另一些肽合成技術見Bodanszky等“Peptide Synthesis”，第2版，John Wiley and Sons，1976。例如，本發明的肽也可以用標準的溶液肽合成法來合成，該方法包括，利用形成酰胺鍵的化學或酶方法分步或封閉偶聯氨基酸或肽片段。這些溶液合成法在本領域內是已知的。
本發明的肽還可以利用本領域專業人員已知的其它技術，如基因工程技術來制備(參見例如T.Maniatis et al.，Molecular Cloning.a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1982)。
現已發現，本發明的肽與上面引用的美國專利申請和論文中所公開的人胸脾素具有相似的生物活性。這種生物活性主要是通過一種試驗來證實的，這一試驗測定了在人T細胞系MOLT-4中誘導生成的cGMP，并與人胸脾素和人胸腺五肽進行比較。在本試驗中由本發明的一種肽誘導生成的cGMP表明，該肽能夠與人細胞上胸脾素受體部位結合，并誘導人胸脾素樣生物活性。
許多目的四肽和五肽比人胸脾素具有更顯著的優點。本發明的許多肽都具有抵抗由消化酶或血清酶引起的降解的特征。因此當給生物學實驗對象注射它們時，其體內半壽期延長。其中許多肽的另一個優點是能夠口服給藥。人胸脾素本身分子太大，不能有效地口服給藥，而且會在胃腸道內被消化。
在對本發明肽進行測試之前，并沒有預料能得到與人胸脾素具有相同生物特異性的四肽或五肽類似物，因為人的牛五肽Sp-5(Arg-Lys-Glu-Val-Tyr)類似物Arg-Lys-Ala-Val-Tyr對MOLT-4細胞沒有活性。因而，具有與完整的人胸脾素分子相同生物活性的人胸脾素五肽類似物和四肽類似物的發現是出人意料的。
由于目的肽具有免疫調節特性，所以它們可用于人體的治療，也可能用于動物的治療，因為它們具有誘導T細胞分化和成熟的能力，而這些T細胞能夠參與機體的免疫反應。因而，認為這些目的肽具有多種治療用途。
本發明的肽被認為可用來輔助機體的集合免疫(collectiveimmunity)，因為它們能增強或輔助對細胞免疫的治療性刺激。從而它們可用于治療與慢性感染有關的疾病，如真菌或支原體感染，結核，麻風、急性和慢性病毒感染等。
一般認為，目的肽或含有這些肽或其酸式鹽或堿式鹽的藥物組合物，可用于任例需要細胞免疫，特別是有免疫缺陷的方面。這樣，如果由于T細胞不平衡而有過量抗體產生，則目的肽可通過刺激T細胞功能而矯正這一癥狀。因此預計這些肽對某些產生有害抗體的自動免疫疾病具有治療作用，這些疾病有系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎等。
目的肽或含有目的肽的藥物組合物，就其最廣泛的應用來說，可用于免疫系統需要調節的患者(人或動物)。此處所用的術語“調節”指目的組合物使免疫系統從異常的疾病狀態恢復到正常的平衡狀態。雖然這種調節作用在免疫缺陷(例如Di George綜合癥)的矯正上有廣泛的應用，但它也適用于矯正免疫活性過剩癥(例如自動免疫疾病)。
因此，本發明包括對免疫系統需要調節的人或動物進行調節的方法及實施這些方法所用的藥物組合物。所述方法包括，以能有效調節免疫系統的量，給所述人或動物服用至少一種肽。
本發明還提供一種由于患者免疫系統(特別是T細胞輔助功能)的相對或絕對缺陷所造成癥狀的治療方法，該方法包括，給所述患者服用有效治療量的至少一種本發明的肽。
此處所用的術語“有效治療量”指能有效地治療上述癥狀的量。本發明還提供一種誘導T細胞分化和成熟的方法，該方法包括，給患者服用有效誘導量的至少一種本發明的肽。
本發明還提供用于實施這些方法的藥物組合物。為制備本發明的藥物組合物，按照常規藥物配制的技術，將作為有效成分的本發明的一種肽與一種藥用載體混合成為均勻的混合物。根據給藥(例如口服給藥、舌下給藥、直腸給藥、經鼻給藥或腸胃外給藥)時所要求的劑型，可以廣泛地改變所述的載體。
在制備較好的口服劑型的組合物時，可以使用任何常用藥用介質。對口服液體制劑(例如懸浮液、酏劑和溶液劑)，所用的介質有例如水、油、醇類、調味劑、防腐劑、著色劑等。可用來制備口服固體(例如粉劑、膠囊劑和片劑)的載體有淀粉、糖類、稀釋劑、成粒劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑等。也可以采用控釋劑型。由于片劑和膠囊劑易于服用，因而是最有利的口服單位劑量形式，很明顯，在這種情況下采用固體藥用載體。如果需要，可利用標準技術將片劑進行糖包衣或腸包衣。
對非腸胃道給藥的產品來說，載體通常是無菌水，但也可以包括其它成分，例如有助于溶解或防腐的成分。也可以制備注射用懸浮液，在這種情況下可以采用適當的液體載體、懸浮劑等。
本發明的四肽或五肽，在以約1μg/kg體重以上，最好是約0.001至10mg/kg體重的量服用時，一般是有效的。通常可以用同樣的劑量范圍治療上述免疫缺陷疾病或癥狀。較大的量(例如約10-100mg/kg體重)用于抑制免疫活性過剩。
給出下列實施例以說明本發明，但并不具體限制本發明。在實例和整個說明書中，各份額按重量計，除非特別說明。這些實例中采用了下列縮寫TFA，三氟乙酸;HOAC，乙酸;CH2Cl2，二氯甲烷;CH3CN，乙腈;DMF，二甲基甲酰胺;NH4OAc，乙酸銨NH4OH，氫氧化銨;n-PrOH，正丙醇;n-BuOH，正丁醇;Pyr，吡啶;DCC，二環已基碳二亞胺;HOBt，1-羥基苯并三唑;DMAP，二甲氨基吡啶;HF，氟化氫;TCA，三氯乙酸;BHA，二苯甲基胺;MeOH，甲醇。
實例1四肽乙酰基-Arg-Pro-Ala-Val-NH2的合成利用固相合成法通過分步偶聯合成上述四肽。所有氨基酸的α-氨基都用叔丁氧羰基(BOC)保護。用甲苯磺酰基(TOS)保護Arg的側鏈。與每當量樹脂的取代作用相比，所用被保護的氨基酸過量2.5當量。所有偶聯操作都用DCC/HOBt并以等當量被保護的氨基酸進行。所有氨基酸都是溶解在CH2Cl2中，但Arg是溶解在DMF中。
洗滌，脫去保護和偶聯步驟如下1，CH2Cl22×3分鐘2，50% TFA-CH2Cl21×3分鐘3，50%TFA-CH2Cl21×30分鐘4，CH2Cl21×3分鐘5，40%異丙醇-CH2Cl22×3分鐘6，CH2Cl22×3分鐘7，10%二異丙基乙基胺 2×10分鐘
8，CH2Cl21×3分鐘9，氨基酸 1×3分鐘10，HOBt 1×3分鐘11，DCC 1×120分鐘12，CH2Cl22×3分鐘13，40%異丙醇-CH2Cl22×3分鐘14，DMF 1×3分鐘15，CH2Cl22×3分鐘a，合成利用Beckman 990型肽合成儀合成被保護的肽。所得四肽樹脂為0.67meg/g，用5.0g(3.35毫摩爾)樹脂開始合成。然后使所得四肽乙酰化，方法是用以下試劑處理樹脂1，CH2Cl22×3分鐘2，50%TFA-CH2Cl21×3分鐘3，50%TFA-CH2Cl21×30分鐘4，CH2Cl21×3分鐘5，40%異丙醇-CH2Cl22×3分鐘6，CH2Cl22×3分鐘7，10%二異丙基乙基胺 2×10分鐘8，CH2Cl21×3分鐘9，50%乙酸酐-CH2Cl2與 1×120分鐘催化量的DMAP10，CH2Cl22×3分鐘11，40%異丙醇-CH2Cl22×3分鐘
12，DMF 1×3分鐘13，CH2Cl22×3分鐘用乙醇(2×50ml)洗滌后，減壓干燥肽樹脂。
b，HF 切落于0℃下用HF(25ml)和苯甲醚(25ml)切落樹脂-肽4小時，得到粗制四肽。減壓除去HF。向該混合物中加入乙醚(150ml)。攪拌該溶液并移至一個燒結玻璃漏斗中，再另外用乙醚(3×100ml)洗滌。用10%HOAc(3×100ml)從樹脂中萃取肽，將水溶液冰凍干燥，得1.20g產物。
c.純化利用制備高效液相層析法(HPLC)純化產物，層析條件如下Whatman Column Partisil M20 10/50 ODS3;300mg樣品，采用15%CH3CN/0.01MNH4OAc恒溶劑系統(用HOAc調節到pH5);流速為15ml/分;檢測波長為220nm。收集所有純部分。蒸去有機溶劑，將水溶液冰凍干燥，得258mg白色固體。
氨基酸分析Pro，1.00;Ala，1.00;Val，1.00;Arg，1.01;83%肽。
薄層層析(Silica 60/Analtech)Rf(Ⅰ)＝0.50(丁醇乙酸水/3∶1∶1)Rf(Ⅱ)＝0.59(丁醇吡啶乙酸水/4∶1∶1∶2)Rf(Ⅲ)＝0.29(丁醇乙酸水乙酸乙酯/1∶1∶1∶1)實例2四肽乙酰基-Arg-Pro-Val-Ala-NH2的合成
a.合成在Applied Biosystems 430A型肽合成儀上制備該四肽。利用Std1循環法(制造廠家的Version 1.40)將每個氨基酸偶聯一次，但BOC-Tos-Arg偶聯兩次。合成中使用下列預先制好的原料反應物 來源 毫摩爾數 量對甲基-BHA-樹脂 ABI 0.50 760mgBOC-Tos-Arg ABI 2.0 857mgBOC-Pro ABI 2.0 430mgBOC-Val ABI 2.0 434mgBOC-Ala ABI 2.0 378mg脫去精氨酸的BOC基團后，中和肽樹脂并洗滌。在4-二甲氨基吡啶(20mg)存在下，用10%乙酸酐的CH2Cl2溶液(15ml)使該化合物乙酰化。60分鐘后，用印三酮試驗對肽進行檢測，以確保完全乙酰化。用CH2Cl2(3×15ml)洗滌肽樹脂并真空干燥(室溫)，得1.0g物質。
b.HF切落在1.5ml苯甲醚存在下，用10ml HF從樹脂上切下該肽。將混合物于0℃下攪拌1.5小時，然后減壓除去HF。用乙醚(3×50ml)洗滌該混合物并空氣干燥。用25%HOAc水溶液(3×50ml)萃取肽/樹脂混合物。
c.純化將水性濾液冰凍干燥，得240mg粗品。將該物質溶于水并使其通過Amberlite IRA 68(乙酸鹽型)離子交換樹脂。合并含肽部分并冰凍干燥(220mg)。
在Whatman Partisil 20M 10 ODS-3(22mm×50cm)柱上純化該肽，用15%乙腈(0.1%三氟乙酸)和0.1%三氟乙酸水溶液作洗脫溶劑(10.0ml/分)。利用HPLC監測洗脫過程，合并適當的部分并減壓除去溶劑。將殘余物溶于H2O中并冰凍干燥兩次，得167mg產物，總產率為50%。
氨基酸分析Arg，1.04;Pro，1.02;Val，1.00;Ala，1.01;72%肽。
薄層層析(硅膠GF250μm板)Rf(Ⅰ)＝0.37(n-BuOH∶HOAC∶H2O/3∶1∶1)Rf(Ⅱ)＝0.15(CHCl3∶MeOH∶HOAC/60∶35∶5)Rf(Ⅲ)＝0.48(n-BuOH∶HOAC∶H2O∶EtOAc/1∶1∶1∶1)實例3四肽乙酰基-Arg-Pro-Asp-Val-NH2的合成a.合成利用Beckman 990型自動合成儀以標準固相合成法合成標題化合物。用5.0g BHA樹脂(0.67meg/g)開始合成。在BOC-Arg(Tos)的偶聯完全后，用50%TFA的CH2Cl2溶液脫去叔丁氧羰基保護基。在催化量的DMAP存在下，用50%乙酸酐的CH2Cl2溶液使樹脂肽乙酰化。用乙醇(2×50ml)洗滌肽樹脂，減壓干燥過夜，然后進行HF切落。干燥的肽樹脂重6.5克。
b.HF切落于0℃下用HF(25ml)和苯甲醚(25ml)切落6.5g樹脂肽4小時，得到粗制的四肽。減壓蒸發HF，向反應混合物中加入乙醚(150ml)。將粗制的肽和樹脂轉移到一個燒結玻璃漏斗中，用乙醚(3×100ml)洗滌。用10%HOAc(3×100ml)萃取肽，將水溶液冰凍干燥，得900mg白色固體。
c.純化將粗產物(經HPLC測定純度為98%)在Sephadex LH-20柱(100g，2.5cm×89cm)上脫鹽，用10%HOAc作洗脫劑。冰凍干燥后，產物重800mg，為白色絨狀固體。
氮基酸分析Arg，0.99;Val，1.00;Pro，1.05;Asp，1.01。
薄層層析(Silica 60/Merck，250F)Rf(Ⅰ)＝0.51(n-BuOH∶HOAc∶H2O/3∶1∶1)Rf(Ⅱ)＝0.60(n-BuOH∶HOAc∶H2O∶EtOAc/1∶1∶1∶1)Rf(Ⅲ)＝0.59(n-BuOH∶吡啶∶HOAc∶H2O/4∶1∶1∶2)實例4N-α-甲酰基-Arg-Pro-Asp-Val的合成a.N-叔丁氧羰基-β-芐基-天冬氨酰-纈氨酸芐基酯在80ml CH2Cl2中溶解3.23g N-叔丁氧羰基-β-芐基-Asp和3.97g Val-芐基酯對甲苯磺酸鹽。加入二異丙基乙基胺(1.74ml)，將該溶液冷卻至5℃。向該混合物中加入2.06g DCC。于5℃下攪拌該混合物30分鐘，然后再在室溫下攪拌2小時。濾出沉淀，濾液用水，10%檸檬酸溶液和飽和碳酸氫鈉溶液萃取。除去溶劑后得到油狀物，在硅膠60上進行層析純化，用97∶3 CH2Cl2-MeOH作為洗脫劑。產物重3.46g，為油狀物。
b.N-叔丁氧羰基-脯氨酰-β-芐基-天冬氨酰-纈氨酸芐基酯將3.41g上述產物用60ml 21 CH2Cl2-TFA脫去保護30分鐘，得油狀的三氟乙酸鹽。用飽和碳酸鈉溶液中和并用CH2Cl2萃取，得到游離胺。蒸發萃取液使其體積減少，然后加到1.05g N-叔丁氧羰基-Pro中。加入0.73gHOBt在2ml DMF中的溶液，而后加入0.99g DCC。攪拌該混合物2.5小時，然后過濾。濾液用水、10%檸檬酸溶液萃取，再用飽和碳酸氫鈉溶液萃取兩次。干燥后，除去溶劑而留下油狀物。產物在硅膠60上進行快速層析純化，用9∶1 CH2Cl2-CH3CN作為洗脫劑。含主要成分的部分得到2.31g無色油狀物。IR光譜1740cm-1，1695cm-1，1675cm-1。
c.N-α-甲酰基-Ng-硝基-精氨酰-脯氨酰-β-芐基-天冬氨酰-纈氨酸芐基酯在2.23g上述產物中加入60ml 1∶2 TFA-CH2Cl2。將該溶液攪拌30分鐘，然后減壓除去溶劑，留下蠟狀固體，用石油醚洗滌該固體。在15ml DMF中溶解0.72gN-α-甲酰基-Ng-硝基-精氨酸和0.33ml N-甲基嗎啉。將該溶液冷卻至-20℃，向其中滴加0.40g氯甲酸異丁酯。將該混合物于-20°至-10℃下攪拌20分鐘，然后加入脯氨酰-β-芐基-天冬氨酰-纈氨酸芐基酯三氟乙酸鹽在20ml DMF和0.33ml N-甲基嗎啉中的冷卻溶液。該混合物于-15℃下攪拌20分鐘，然后移走冷卻浴，在室溫下繼續攪拌2小時。減壓除去大部分溶劑。將殘余物溶于50ml CH2Cl2中，用水、10%檸檬酸溶液和飽和碳酸氫鈉溶液萃取。干燥有機層并蒸發溶劑，得2.08g產物。
薄層層析(硅膠GF)Rf(Ⅰ)＝0.56(CH2Cl2∶MeOH/9∶1)Rf(Ⅱ)＝0.72(CHCl3∶MeOH∶HOAc/8∶1∶1)d.N-α-甲酰基-精氨酰-脯氨酰-天冬氨酰-纈氨酸以鈀黑作催化劑，用30ml 5%甲酸-甲酸銨進行轉移氫化而脫去保護。將反應混合物在具塞圓底燒瓶中攪拌18小時。用硅藻土過濾該混合物后，減壓除去溶劑。將殘余物溶于水中并進行冰凍干燥。產物在1.6×60cm DEAE-Sephadex柱上進行純化。用0.02M碳酸氫銨(pH8.5)開始洗脫，收集150滴為一份。收集52份后，開始用2升以上的0.02-0.20M碳酸氫銨進行梯度洗脫。層析圖中洗脫出的最大峰集中在第88份。合并第75-100份并冰凍干燥，得到絨狀無定形固體。HPLC用10%MeOH-0.01N NH4OAc(pH5)在Bondapak-C18柱上以1.5ml/分的流速洗脫，保留時間＝9.4分。
薄層層析(硅膠60)Rf(Ⅰ)＝0.16(n-BuOH∶HOAc∶H2O/3∶1∶1)Rf(Ⅱ)＝0.27(n-BuOH∶HOAc∶H2O∶Pyr/15∶3∶12∶10)Rf(Ⅲ)＝0.42(EtOAc∶Pyr∶HOAc∶H2O/5∶5∶1∶3)氨基酸分析Asp，0.99;Pro，0.97;Val，1.05;Arg1.00;38%肽。
實例5五肽Arg-Pro-Ala-Val-Tyr的合成用固相法合成該肽，用BOC-(BZLCl2)-Tyr樹脂酯(4.4g，0.40meg/g)為起始原料。將該樹脂依次用各3當量的BOC-Val、BOC-Ala、BOC-Pro和CBZ3-Arg偶聯。偶聯劑為DCC和HOBt在4∶1 CH2Cl2∶DMF中的溶液。于0℃下將該樹脂用HF(40ml)在苯甲醚(5ml)中的溶液切落45分鐘。固體殘渣用10%HOAc萃取，過濾，將水溶液冰凍干燥，得1.56g粗制肽。
通過Sephadex SPC 25層析(2.6×90cm柱)進行純化，用NH4OAc進行階式梯度洗脫0.05M，pH5(2升)，0.15M，pH5(1升)，0.15M，pH6.7(2升);流速為100ml/小時，以12.5ml為一份，280nm檢測。分離第198-207份，得標題肽，為1.13g無色固體。
薄層層析(硅膠G250)
Rf＝0.24(n-PrOH∶NH4OH/84∶37)Rf＝0.64(三氟乙醇∶NH4OH/78∶22)Rf＝0.58(n-BuOH∶HOAc∶H2O∶pyr/15∶3∶12∶10)氨基酸分析Arg，1.00;Ala，0.96;Pro，0.97;Val，1.03;Tyr，1.01;67%肽。
實例6生物活性cGMP試驗按測定人胸脾素和胸腺五肽生物活性的方法，本試驗測定了本發明的肽與完整MOLT-4細胞的細胞膜受體結合并選擇性地刺激cGMP生成的能力。
MOLT-4細胞系得自美國馬里蘭州諾克維爾典型培養物收藏處(American Type Culture Collection of Rockville，Md.)如T，Audhya等人所述(Arch，Biochem，Biophys，234167-177，1984)，新接種MOLT-4細胞后，培養3天并收集之。細胞用PBS洗3次，以1.0×107個細胞/ml的濃度再懸浮于RPMI 1640中，使其在37℃下平衡30分鐘，然后加入試驗四肽和五肽(25μl)及對照肽。在振蕩水浴中繼續培養4-5分鐘，然后加入1ml冰冷的TCA(10%)停止培養。
將TCA中的細胞勻漿并進行超聲處理，釋放出環核苷酸。將該懸浮液于4℃下以3000×g離心20分鐘。將所得沉淀溶解于0.1NNaOH中以測定蛋白含量。用5ml水飽和的乙醚萃取4次，從上清液部分中除去TCA。最后一次萃取后，在50℃水浴中加熱10分鐘而除去殘留的少量乙醚。冰凍干燥后，將樣品溶解于50mM乙酸緩沖液(pH6.2)中進行cGMP的放射免疫測定。
圖1顯示了活性肽乙酰基-Arg-Pro-β-D-Asp-Val-NH2、Arg-Pro-Ala-Val-Tyr和乙酰基-Arg-Pro-Ala-Val-NH2在MOLT-4細胞中的典型劑量-反應曲線，并與胸腺五肽和非活性肽乙酰基-Arg-Pro-Asp-Pro-NH2、Ala-Lys-Asp-Val和Lys-Lys-Asp-Val-NH2作了比較，所測濃度為1000μg/ml。圖2顯示了MOLT-4細胞中活性肽乙酰基-Arg-Pro-Val-Ala-NH2的劑量反應曲線，并與胸腺五肽標準物進行了比較，所測濃度為1～100μg/ml。
測定了每個受試肽的閾活性。閾活性定義為誘導出比對照高兩個以上標準差的細胞內cGMP水平的最低試驗肽濃度。對照組的細胞內cGMP水平小于0.5微微摩爾/ml(平均值±標準差)。如果cGMP水平比平行陰性對照所測水平高2倍(2個標準差)以上，則認為試驗結果為陽性。
cGMP試驗結果示于圖1及其相應的表Ⅰ、圖2及其相應的表Ⅱ，在這些試驗中測定了本發明的具有代表性的肽，并與胸腺五肽和對照肽作了比較。將這些結果與胸腺五肽(Arg-Lys-Asp-Val-Tyr)對MOLT-4的作用作比較是因為人胸脾素五肽“Sp-5”(Arg-Lys-Ala-Val-Tyr)對MOLT-4無活性。這些結果證實了本發明肽的生物活性，即在MOLT-4細胞中刺激T細胞輔助活性。
表ⅠcGMP濃度(微微克/ml)肽濃度 (μg/ml): 1 10 100 1000Arg-Lys-Asp-Val-Tyr 6.4 18.3 20.8 21.9Arg-Pro-Asp-Val-NH20.1 17.1 19.3 24.8乙酰基-Arg-Pro-Asp-Val-NH24.55 8.99 19.62 24.09乙酰基-Arg-Pro-Glu-Val-NH24.7 9.41 16.76 25.00乙酰基-Arg-Pro-Ala-Val-NH27.1 14.6 19.1 24.5乙酰基-Arg-Aib-Glu-Val-NH23.7 11.0 17.7 24.9乙酰基-Arg-Pro-Gln-Val-NH218.75 29.68 34.98 40.23乙酰基-Arg-Pro-Glu-Val 4.1 11.9 7.9 30.8乙酰基-Arg-Aib-Ala-Val-NH218.78 30.45 36.17 39.48乙酰基-Arg-Pro-B-D-Asp-Val-NH26.6 14.3 20.5 25.0乙酰基-Arg-Pro-B-Asp-Gly-NH220.56 31.83 36.66 34.95Lys-Lys-Asp-Val-NH20.33 0.31 0.34 0.33Lys-Arg-Asp-Val 0.44 0.43 0.44 0.39Arg-Gly-Asp-Ser 0.71 0.50 0.68 0.58Arg-Pro-Ala-Val-Tyr 0.09 16.41 27.90 37.14Arg-Pro-Ala-Val-Tyr-NH23.71 14.15 12.83 12.57乙酰基-Arg-Lys-Ala-Val-Tyr-NH23.00 8.86 12.83 18.43肽濃度為0的對照實驗結果在0-0.3微微克/ml間變化。
表ⅡcGMP濃度(微微克/ml)肽濃度 (μg/ml): 1 10 100 1000Arg-Lys-Asp-Val-Tyr 3.55 13.56 18.70 24.85乙酰基-Arg-Pro-Val-Ala-NH27.77 17.39 24.47 --注意本底為0.19微微摩爾cGMP/ml。
實例7酶穩定性為說明本發明肽對腸道和血清酶降解作用的穩定性，將示例性肽乙酰基-Arg-Pro-Asp-Val-NH2放在大鼠腸液和人血清中于37℃下保溫120分鐘。作為比較，將四肽Arg-Lys-Asp-Val和胸腺五肽作同樣處理。HPLC表明，25秒后，Arg-Lys-Asp-Val即完全消化。在約20秒時，胸腺五肽降解50%。本發明肽則至少在120秒內，在血清和腸液中基本上都未降解。
提出上述實例僅為說明目的，并不限制如權利要求書中所述的本發明范圍。
權利要求
1.具有下式的四肽或其藥學上可接受的酸或堿加成鹽在制備用于調節感染患者免疫系統的藥物組合物中的應用其中R為H、低級烷基、乙酰基、甲酰基、或低級鏈烷酰基；X為Pro、脫氫-Pro或羥基-Pro；Y為選自Ala、Asp、β-Asp或Val的D或L型氨基酸；Z為選自Val或Ala的D或L型氨基酸；R1為NR2R3，其中R2和R3為H或直鏈或支鏈含1至6個碳原子的烷基或含2至6個碳原子的烯基，任選被一個芳基或帶有取代基的芳基取代，所述取代基或者是一個鹵素，或者是一個直鏈或支鏈含1至6個碳原子的烷基或含2至6個碳原子的烯基；或者，R2和R3一起構成一個有3至7個碳原子的環亞甲基。
2.具有下式的四肽或其藥學上可接受的酸或堿加成鹽在制備用于調節患者體內T細胞功能缺損或過剩的藥物組合物中的應用其中R為H、低級烷基、乙酰基、甲酰基、或低級鏈烷酰基;X為Pro、脫氫-Pro或羥基-Pro;Y為選自Ala、Asp、β-Asp或Val的D或L型氨基酸;Z為選自Val或Ala的D或L型氨基酸;R1為NR2R3，其中R2和R3為H或直鏈或支鏈含1至6個碳原子的烷基或含2至6個碳原子的烯基，任選被一個芳基或帶有取代基的芳基取代，所述取代基或者是一個囟素，或者是一個直鏈或支鏈含1至6個碳原子的烷基或含2至6個碳原子的烯基;或者，R2和R3一起構成一個有3至7個碳原子的環亞甲基。
3.具有下式的五肽或其藥學上可接受的酸或堿加成鹽在制備用于調節感染患者免疫系統的藥物組合物中的應用其中R2為H、低級烷基、乙酰基、甲酰基、低級鏈烷酰基或脫氨基;X′為Pro、脫氫-Pro或羥基-Pro;Y′為D-Val或L-Val;Z′為D-Tyr或L-Tyr;R3為OH或NR4R5，其中R4和R5為H或一個含1至6個碳原子的直鏈或支鏈烷基或烯基，任選被一個芳基或帶取代基的芳基取代，所述取代基或者是一個囟素，或者是一個含1至6個碳原子的直鏈或支鏈烷基或烯基;或者，R4和R5一起構成一個有3至7個碳原子的環亞甲基。
4.具有下式的五肽或其藥學上可接受的酸或堿加成鹽在制備用于調節患者體內T細胞功能缺損或過剩的藥物組合物中的應用其中R2為H、低級烷基、乙酰基、甲酰基、低級鏈烷酰基或脫氨基;X′為Pro、脫氫-Pro或羥基-Pro;Y′為D-Val或L-Val;Z′為D-Tyr或L-Tyr;R3為OH或NR4R5，其中R4和R5為H或一個含1至6個碳原子的直鏈或支鏈烷基或烯基，任選被一個芳基或帶取代基的芳基取代，所述取代基或者是一個囟素，或者是一個含1至6個碳原子的直鏈或支鏈烷基或烯基;或者，R4和R5一起構成一個有3至7個碳原子的環亞甲基。
全文摘要
公開了具有人胸脾素分子的生物活性的四肽和五肽。還提供了含有這些肽的藥物組合物及其使用方法。
文檔編號G01N33/50GK1104217SQ9410815
公開日1995年6月28日 申請日期1994年7月21日 優先權日1988年5月19日
發明者塔彭·奧德雅, 吉迪安·戈爾茨坦, 喬治·希夫納 申請人:免疫生物學研究所有限公司