玉米ZmWx基因在提高玉米產量和改良籽粒性狀中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬作物生物工程育種領域，具體說，涉及一種玉米ZmWx基因在提高玉米產 量和改良籽粒性狀中的應用。
【背景技術】
[0002] 淀粉是人類食物不可或缺的組成成分，也是食品工業和化學工業的重要原材料， 在人類生活中扮演著重要角色。隨著淀粉加工工業的快速發展，淀粉的用途不斷擴寬，特別 是燃料乙醇的生產，致使淀粉的需求量急劇攀升。玉米作為全世界第一大作物，其產量高于 小麥和水稻，并且在各種作物淀粉中，玉米淀粉具有最佳的化學組成，產量最高。2013年全 球淀粉產量約6880萬噸，其中玉米淀粉約6100萬噸，占總量的89%。我國淀粉加工業90% 以上以玉米為原材料。在普通玉米籽粒中，淀粉含量一般在65%左右。淀粉含量高于74% 的高淀粉玉米具有良好工業用途。目前我國主要推廣的高淀粉玉米以混合型高淀粉玉米為 主，其粒重、胚乳重均高于普通玉米，且胚乳所占比例較大，籽粒蛋白含量與普通玉米差異 不大，但粗脂肪含量低于普通玉米。
[0003] 淀粉是葡萄糖分子通過α-1，4糖苷鍵或α-1，6糖苷鍵聚合而成的大分子碳水化 合物，根據結構的不同，可分為直鏈淀粉和支鏈淀粉。普通玉米籽粒淀粉中，直鏈淀粉一般 占25-30%，支鏈淀粉占70-75%。直鏈淀粉分子量較小，一般是由200-5000個葡萄糖單 位以α-1，4糖苷鍵構成的線性分子，只含少量分支（平均每1000個葡萄糖單位中少于一 個）。普通玉米直鏈淀粉的聚合度一般為230-2370,與水稻直鏈淀粉類似，而馬鈴薯直鏈淀 粉的聚合度較大，一般為970-9770(HanashiroandTakeda1998)。支鏈淀粉多數分子量 大，一般由5000個以上葡萄糖單位組成，含有較多分支，分支點處以α-1，6糖苷鍵連接，分 支鏈的長度從6-100DP(聚合度，degreeofpolymerization)不等。玉米支鏈淀粉的數均 聚合度（DPn)為15900,其大型、中型和小型分子的DPn分別為26500、8400、1100,摩爾分數 分別為54%、16%、30%;質量分數分別為90%、8%、2%〇^1?5(^6丨31.2003)。直鏈淀粉 與支鏈淀粉的結構特點決定了二者具有較大的理化特性差異。
[0004] 淀粉的分子結構決定了淀粉的蒸煮品質和工業用途，結構參數包括直鏈淀粉/支 鏈淀粉比例（直/支比）、直鏈淀粉聚合度以及支鏈淀粉分支鏈長和分布。其中直/支比 對淀粉特性和用途影響最大，高純度的支鏈淀粉或直鏈淀粉更能滿足食品和工業加工的不 同需求。支鏈淀粉具有較大的粘度和膨脹系數，應用于食品加工中能增加粘糯口感和膨化 食品的體積，并且在工業領域多作為粘合劑使用。直鏈淀粉相比于支鏈淀粉，用途更加廣 泛，以其具有不溶于水特性、低粘度、較高的糊化溫度、良好的成膜性、抗潤脹性、高穩定性， 成為了糖果、造紙、紡織、制藥、和塑料生產領域理想的原材料。尤其是直鏈淀粉可以被應用 于生產光解型農用塑料薄膜，能夠取代傳統的不可降解塑料，有效減少"白色污染"，是全球 都關注的熱點產品。近年來，以直鏈淀粉為原料生產的抗性淀粉成為飲食健康方面的新焦 點。抗性淀粉具有類似膳食纖維的結構特性，在小腸內不能被消化水解為葡萄糖，不易進入 循環系統而使血糖增高。因此，抗性淀粉是糖尿病人的理想食品，同時也可被開發為健康有 效的減肥食品。由此，越來越多的研究人員致力于直鏈淀粉的提純和高直鏈淀粉作物的育 種工作。
[0005] 在禾谷類胚乳中淀粉的合成是一個多酶催化的復雜過程，主要涉及四大類酶： ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase)、淀粉合成酶（SSs)、淀粉分支酶（SBEs)、淀粉去分支酶 (DBEs)。這四大類酶都包括許多家族成員，各成員又有精細分工，在淀粉合成過程中發揮不 同的作用。近年來，隨著大量淀粉合成相關酶類突變體的發現和基因工程技術的迅猛發展， 結合正向遺傳學與反向遺傳學分析，學者們對各類酶及家族成員的表達模式、結構、亞細胞 定位、催化特性以及表達調控等的研究取得了長足進展。
[0006] 直鏈淀粉主要是由顆粒結合型淀粉合成酶GBSSI負責合成的。淀粉合成酶將 ADPG(ADP-葡萄糖）中的葡萄糖基添加到支鏈淀粉的分支鏈或直鏈淀粉的非還原性末端。 淀粉合成酶可分為5個家族：SSI、SSII、SSIII、SSIV和GBSS。它們分別延伸支鏈淀粉中 不同聚合度的支鏈，或者延伸線性的直鏈淀粉鏈。GBSS家族有兩個成員：GBSSI和GBSSII。 GBSSI由Wx基因編碼，主要負責胚乳和花粉粒中直鏈淀粉的合成。GBSSII主要在葉片中表 達，負責非儲藏器官中的直鏈淀粉的合成。在玉米、小麥、水稻、馬鈴薯的GBSSI缺失突變體 中，貯藏器官淀粉粒中僅含有支鏈淀粉組分，幾乎不含有直鏈淀粉成分。在這些突變體中， 直鏈淀粉的缺失不影響淀粉粒的表型，這表明只有支鏈淀粉是淀粉粒結構不可或缺的組成 部分（Zeemanetal. 2010)。GBSSI區別于其他家族淀粉合成酶的兩大特征是它僅限于淀 粉粒的嚴格亞細胞定位和它發揮作用的模式。與可溶性淀粉合成酶不同，GBSSI是唯一能 夠連續地延伸直鏈淀粉的淀粉合成酶，生成長的寡糖鏈。與此相反，其它淀粉合成酶在淀粉 粒中和淀粉體基質中均有定位，只負責支鏈淀粉分支鏈的合成，不能合成直鏈淀粉。
[0007] 越來越多的證據表明，在高等植物中，GBSSI負責的直鏈淀粉合成起始于引子 M0S(Denyeretal. 1996)。68331合成直鏈淀粉的能力表現為既能夠利用低聚麥芽糖（105) 為引物合成直鏈淀粉，也能夠作用于支鏈淀粉的側鏈，負責超長鏈的合成。在碘結合法測定 直鏈淀粉含量時，支鏈淀粉中的超長鏈也被算作為表觀直鏈淀粉含量的一部分。將正常的 Wx基因導入水稻wx突變體中，胚乳表觀直鏈淀粉含量增加至22 %左右，而其中真正的直鏈 淀粉含量為16%左右，其它部分為超長鏈，表明Wx基因的導入對支鏈淀粉最大的影響是增 加了超長鏈含量（Hanashiroetal.2008)。在小麥和馬鈴薯中也有類似的報道（Kitahara etal. 2007) 〇
[0008] 在高等植物淀粉儲存器官發育中，直鏈淀粉含量的增加開始于發育中后期。在玉 米中，胚乳直鏈淀粉的含量在授粉后14天到28天中由18%增加到26. 5%。有4類因素影 響GBSSI合成直鏈淀粉的能力，即有功能的Wx基因拷貝數及其轉錄本、對引物M0S的親和 力、底物ADPG含量和淀粉粒中支鏈淀粉的結構特性。在玉米突變體胚乳中，有功能的Wx基 因拷貝數與GBSSI酶活性以及直鏈淀粉含量（AC)成正相關，其中Wx基因拷貝數與酶活性 成線性關系（Tsai1974)。盡管其它淀粉合成酶也能在M0S上添加一個葡萄糖基，但這之后 淀粉合成酶（SS)與低聚麥芽糖解離，不能再繼續延長，而GBSSI能夠一個接一個地連續將 葡萄糖基連入M0S直至合成直鏈淀粉。GBSSI對M0S的親和力是其它淀粉合成酶的20倍以 上，因此，在體內M0S濃度很低的情況下GBSSI仍能夠有效地結合M0S并使之延伸。Denyer 等還發現離體的可溶性GBSSI對M0S的親和力非常低并且不再能持續地延伸M0S，然而當 向體系中加入少量支鏈淀粉時，GBSSI對M0S的親和力提高并能夠持續延伸。這表明GBSSI 對MOS的重要且獨特的特性可能依賴于與淀粉粒中支鏈淀粉網格的相互作用。
[0009] ADPG作為底物其濃度是影響GBSSI合成直鏈淀粉能力的另一重要因素。熱力學 分析和實驗證據表明，ADPG的供應狀態限制體內直鏈淀粉的合成。相比于負責支鏈淀粉 合成的其他淀粉合成酶，GBSSI對ADPG的親和力低，例如在豌豆中GBSSI對ADPG的&為 1. 4mmol/L，而其它SS對ADPG的K"在0. 06-0. 6mmol/L。在淀粉體內ADPG的濃度接近于其 它SS催化反應的飽和值，而低于GBSSI的適宜底物濃度。在ADPG合成受阻突變體中，直鏈 淀粉含量降低幅度大于支鏈淀粉含量降低的幅度。可以說ADPG含量是限制直鏈淀粉合成 的一個重要因素。然而缺乏玉米胚乳中該方面的研究報道。
[0010] GBSSI隨著淀粉粒的生長而被固定在其中，不能像其它SS那樣在淀粉體基質中移 動。淀粉粒中支鏈淀粉的結構矩陣能夠通過多種方式來影響GBSSI活性以及直鏈淀粉含 量。支鏈淀粉的密集矩陣對ADPG和M0S的滲透有阻礙作用，隨著與淀粉粒表層距離的增 加，ADPG和M0S的濃度隨之減少，造成GBSSI的底物供應不足。然而這種緊密的矩陣也使 得GBSSI新合成的聚合度較低的M0S被困在GBSSI周圍而不易擴散出去，有利于GBSSI催 化形成的多聚糖鏈的持續延伸。因此，支鏈淀粉結構的存在不僅賦予了GBSSI能有效結合 并延伸M0S的動力學特性，也影響了ADPG和M0S的滲透性，影響GBSSI的酶活力。這解釋 了為什么在普通淀粉粒中直鏈淀粉含量僅在25-30%左右而不再提高。
[0011] 對GBSSI的缺失突變以及抑制Wx基因表達的研究表明，GBSSI酶活性與直鏈淀 粉含量成正相關。Wx基因功能的完全缺失將導致直鏈淀粉含量的嚴重降低（0-5%)，甚 至致使淀粉中僅含有100%支鏈淀粉。盡管GBSSI對直鏈淀粉的合成有如此重要的的作 用，但是對Wx基因的過表達是否影響籽粒直鏈淀粉含量報道很少。Sestili等報道將小麥 Wx-B1基因通過基因槍轟擊法轉入硬粒小麥中，轉基因小麥的直鏈淀粉含量并沒有明顯提 高（Sestilietal.2012)，推測在硬粒小麥中2種不同的GBSSI亞型（Wx-Al、Wx-Bl)可提 供足夠的酶活性催化直鏈淀粉合成，在小麥中過表達Wx-Bl基因對直鏈淀粉含量的影響十 分有限。由于GBSSI蛋白隨著淀粉粒的生長而被固定在其中，不能像其它SS那樣在淀粉體 基質中移動，其周圍可被利用的底物數量有限，因此，增加GBSSI蛋白在胚乳中的豐度以提 高直鏈淀粉合成能力仍是值得關注的途徑。

【發明內容】

[0012] 針對目前的研究現狀，本發明要解決的問題是提供玉米ZmWx基因在提高玉米產 量和改良籽粒性狀中的應用。
[0013] 本發明中，從NCBI數據庫和玉米基因組測序資料中查詢獲取玉米ZmWx基因（編 碼顆粒結合型淀粉合成酶GBSSI)的cDNA序列，發現玉米中只有一種GBSSI蛋白。對后者 的編碼序列進行GC%分析發現，其GC%高達66. 36%。
[0014] 以玉米胚乳cDNA為模板，根據玉米基因組測序資料設計引物擴增ZmWx基因全 長序列。由于GC含量高，用普通高保真酶未能擴增出來目的片段；改用LA Taq酶配合GC buffer II成功克隆出ZmWx基因全長序列。將所述全長序列連入pEASY-Blunt克隆載體后 送交測序。擴增出的ZmWx基因含有完整的編碼序列，但有3堿基與數據庫中序列不一致，其 編碼的氨基酸未發生改變。這些差異可能是由于cDNA模板的供體為自交系鄭58,其ZmWx 基因與自交系B73的序列存在單核苷酸多態性所導致。
[0015] 本發明所述玉米ZmWx基因在提高玉米產量和改良籽粒性狀中的應用。
[0016] 其中：所