結合irf5的細胞穿透肽的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明包括結合干擾素調節因子5 (IRF5)和破壞IRF5同源二聚化和/或減弱下 游信號傳導的細胞穿透肽，和用于篩選所述抑制IRF5的肽的方法。
【背景技術】
[0002] IRF5是調節自體免疫病因學的關鍵成分，包括系統性紅斑狼瘡（SLE)和IL6和 IL12的下游調控的推定治療靶標。多種全基因組關聯研宄（GWAS)報道了 IRF5多態性與 增加的SLE風險相關，與現有的臨床前文獻一起提供了令人信服的理由證實阻斷IRF5功能 可能有益于 SLE 患者（Agarwal ;Cunninghame 等人；Demirci 等人；Dieud6 和 Dawidowicz) 〇 在臨床前文獻中提出的數據對IRF5在調節自體免疫性疾病病因的關鍵成分中的重要作 用提供了重要的線索。然而，靶向IRF5的特異工具的缺乏限制了使用針對IRF5的SiRNA 或使用IRF5基因敲除小鼠的早期革巴標評價努力（Beal ;Feng等人；Kozyrev和Alarcon ; Krausgruber 等人；Lien 等人）。
[0003] 此外，阻斷IRF5功能將影響在表達IRF5的SLE相關細胞類型（單核細胞、巨噬 細胞、漿細胞樣樹突細胞和B細胞）中的Toll樣受體7/8/9的信號傳導。因此，靶向IRF5 可以通過減弱去調控的信號傳導，如導致由PDC產生干擾素、由單核細胞/巨噬細胞產生 IL-12, IL6和TNF α、以及由B細胞產生自身抗體的TLR7/8/9信號傳導，顯著有益于SLE或 其他自體免疫性疾病的患者，在這些疾病中IRF5信號傳導起顯著的作用。
[0004] 細胞穿透肽（CPP)是一類具有以相對無毒的方式運送多種否則不通透的大分子 跨越細胞質膜能力的肽。CPP肽通常5至約30個氨基酸（aa)長，具有陽離子、兩性、或疏水 性質。細胞穿透肽著名的例子包括Tat、穿透素（Penetratin)和運輸蛋白（Transportan) (Fawell，S.等人 Proc. Natl. Acad. Sci. 1994，第 664-668 頁；Theodore, L.等人 J. Neurosci. 1995,第 7158-7167 頁；Pooga, M.等人 FASEB J. 1998,第 67-77 頁）。細胞穿 透肽如Tat可以附著至效應肽，或者效應肽可以固有地是細胞穿透的。固有地是細胞穿透 的效應肽的實例包括 Arf (1-22)和 p28 等等（Johansson, H. J.等人Mol. Ther. 2007, 16(1)， 第 115-123 頁；Taylor, B. N.等人 Cancer Res. 2009, 69 (2)，第 537-546 頁）。
[0005] 為了正確地剖析IRF5的作用，并抑制靶標二聚化，所謂的工具分子（小分子或肽） 是必要的。雖然IRF5的晶體結構是已知的（Chen等人），但是缺乏既靶向IRF5又抑制同源 二聚化，從而調節IRF5功能的特異工具（小分子或肽）。
[0006] 本發明著重在新的細胞穿透肽，其設計成既達到靶標、又抑制對二聚體形成（調 節核易位及功能的關鍵步驟）重要的殘基。由于缺乏生化地評估這些細胞穿透肽的直接方 法和其它靶向IRF5二聚化的工具分子，建立了新的基于FRET的生化測定法。在本專利中 描述的生化測定法鑒定了抑制IRF5二聚化的工具。
[0007] 因此，本發明一般地涉及肽，其是細胞穿透的，并具有與IRF5結合和破壞IRF5同 源二聚化和/或減弱下游信號傳導的能力，本發明還涉及測試、篩選和評估肽的方法，特別 是結合和/或抑制IRF5的細胞穿透肽。
【附圖說明】
[0008] 圖1 :該圖描述了示范性的本發明FRET二聚體測定法的原理和驗證。圖IA提供了 實施例12中詳細描述的生化IRF5FRET二聚體測定法的示意圖。圖IB和IC用來驗證生化 測定法的用途。在這些實驗中，生物素標簽IRF5蛋白（200nM)與等體積遞增量的6-His(以 下稱His)標簽IRF5蛋白混合。橫坐標代表his標記的IRF5的濃度，縱坐標代表發生的 TR-FRET測量值。已經在文獻中表明（Royer等人，2010) S430的磷酸化促進IRF5的二聚 化。S430D突變體被認為是磷酸模擬物（phosphomimetic)。在圖IB中，Kd(yM)表明二聚 化的次序為S430D :S430D〈S430D :野生型〈野生型：野生型，這些觀察結果與文獻報道值一 致。圖IC示出了 S430D+R353D突變體的TR_FRET信號顯著降低，也與IRF5二聚化的預期 行為符合。
[0009] 圖2 :此圖示出結合IRF5的本發明的標記肽。圖2A提供了實施例13中詳細描述 的直接生化結合FRET測定法的示意圖（FITC CPP結合到IRF5(222-425))。在這些實驗中， 本發明標記的細胞穿透肽，具體地，經FITC標記的形式的SEQ ID NOS 13-14和4-7(100nM) (SEQ ID NOS 16-21)與遞增濃度的N末端His (6組氨酸）-標記的IRF5 (222-425) SEQ ID NO :22混合。以下圖2B和2C中橫坐標代表his標記的IRF5 (222-425,缺少螺旋5,并且不 能同源二聚化）的濃度（μ M)，縱坐標表示在經FITC標記的形式的SEQ ID NOS 13-14和 4-7 (SEQ ID NOS 16-21)存在下，TR-FRET的測定值。Kd表明所有六種FITC形式的SEQ ID NOS 13-14和4-7 (SEQ ID NOS 16-21)直接結合所測試的IRF5蛋白。設計為不結合IRF5 的對照經FITC標記的CPP (SEQ ID NO :23)不顯示任何親合力。
[0010] 圖3 :此圖表示在HeLa細胞中孵育2小時（h)(圖3A)和24小時（h)(圖3B)后， 經 FITC 標記的 CPP' s (CPP 是 SEQ ID NO :13-14 和 4-7, FITC-標記的形式的 SEQ ID NOS 13-14和4-7是SEQ ID NOS 16-21)的定位，并由此確認測試的CPP是細胞穿透的。所使用 的方案詳細描述在實施例14。簡言之，HeLa細胞用10 μ M或3 μ M濃度的FITC標記的CPP 處理2小時和24小時時間點（分別為圖A和圖Β)。在40χ放大下獲得圖像。
[0011] 圖4 :該圖示出了與對照（V)相比SEQ ID NOS 13-14和4-7減弱在THP-I (人單 核細胞系）中IL-6的生產。如實施例15所述，THP-I細胞用50 μ M的這些CPP' s (SEQ ID NO :13-14和4-7)預處理30分鐘，并用10μΜ R848(TLR7/8激動劑）ο/η刺激。橫坐標表示 處理條件，縱坐標表示歸一化至載體（沒有肽但用10 μ M R848刺激）的產生的IL6量和如 通過細胞滴度glo測定的細胞數。SEQ ID NO :13-14和4-7都減弱R848刺激的IL6生產。
[0012] 圖5A-5F :這_圖示出了 SEQ ID NO 13-14和4-7以濃度依賴的方式減弱R848誘 導的人外周血單核細胞（PMBC)中的IL-12生產。如實施例16所述，用SEQ ID NO 13-14和 4-7預處理從健康人類志愿者中分離的PBMC 30分鐘，并用1 μ M R848 (TLR7/8激動劑）o/n 刺激。橫坐標表示使用的化合物濃度，縱坐標表示IL12的量。SEQ ID NO 13-14和4-7都 以濃度依賴的方式減弱R848刺激的PBMC的IL-12生產。效力的次序為SEQ ID NO :14〈SEQ ID NO ：4<SEQ ID NO ：6<SEQ ID NO ：5<SEQ ID NO ：7<SEQ ID NO ：13〇
[0013]
[0014] 除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬技術領域 的普通技術人員通常理解的相同含義。盡管在實踐或測試本發明時可以使用類似或等同于 本文描述的方法和材料，如下描述了合適的方法和材料。
[0015] 除非另有說明，在本申請中使用的命名法是基于IUPAC系統命名法。
[0016] 除非另外指出，本文提及的所有肽序列都根據常規慣例寫入，由此N末端氨基酸 在左邊和C-末端氨基酸在右邊。兩個氨基酸殘基之間的短線表示肽鍵。當氨基酸具有異 構體形式時，除非另有明確指示，其是所表示氨基酸的L型。
[0017] 術語"氨基酸"是指通式Nh2CHRCOOH的有機化合物，其中R可以是任何有機基團。 具體地，術語氨基酸可以指天然和非天然（人造）氨基酸。為方便描述本發明，使用對于多 種氨基酸殘基的常規和非常規縮寫。這些縮寫是本領域技術人員所熟知的，但為了清楚在 下面列出：
[0018] ASP = D =天冬氨酸；Ala = A =丙氨酸；Arg = R =精氨酸；Asn = N =天冬酰 胺；Gly = G =甘氨酸；Glu = E =谷氨酸；Gln = Q =谷氨酰胺；His = H =組氨酸；Ile = I =異亮氨酸；Leu = L =亮氨酸；Lys = K =賴氨酸；Met = M =甲硫氨酸；Nle =正亮氨 酸；Phe = F =苯丙氨酸；Pro = P =脯氨酸；Ser = S =絲氨酸；Thr = T =蘇氨酸；Trp = W =色氨酸；Tyr = Y =酪氨酸；和Val = V =繳氨酸。
[0019] 術語"氨基酸基序"是指氨基酸的保守序列（例如? ---L--V)。該序列還可以包 括空隙，以指示分隔基序的每個氨基酸的殘基的數目。
[0020] 本發明的細胞穿透肽（CPP)表示約5至約30個氨基酸的肽，沒有通過連接兩個或 以上非天然氨基酸而形成的橋或環狀肽的形式的構象限制（即，其不是"訂書肽（stapled p印tide) "），并且其能夠穿透細胞膜（例如使不同物質易位進入細胞）。
[0021] 短語"結合IRF5的肽"或"能夠結合IRF5的肽"表示在靶標是IRF5的生化測定 法中是陽性的（在本文中定義為IC 50〈75uM)那些肽的組。
[0022] 術語"IRF5"（干擾素調節因子5)表示蛋白質，其通常包含如下的氨基酸序列
[0023] MNQSIPVAPTPPRRVRLKPWLVAQVNSCQYPGLQWVNGEKKLFCIPWRHATRHGPSQD⑶NTIFKAWAK ETGKYTEGVDEADPAKWKANLRCALNKSRDFRLIYDGPRDMPPQPYKIYEVCSNGPAPTDSQPPEDYSFGAGEEEEE EEELQRMLPSLSLTEDVKWPPTLQPPTLRPPTLQPPTLQPPVVLGPPAPDPSPLAPPPGNPAGFRELLSEVLEPGPL PASLPPAGEQLLPDLLISPHMLPLTDLEIKFQYRGRPPRALTISNPHGCRLFYSQLEATQEQVELFGPISLEQVRFP SPEDIPSDKQRFYTNQLLDVLDRGLILQLQGQDLYAIRLCQCKVFffSGPCASAHDSCPNPIQREVKTKLFSLEHFLN ELILFQKGQTNTPPPFEIFFCFGEEWPDRKPREKKLITVQVVPVAARLLLEMFSGELSWSADSIRLQISNPDLKDRM VEQFKELHHIWQSQQRLQPVAQAPPGAGLGVGQGPWPMHPAGMQ(同種型 1，SEQ ID N0:11)。備選地， IRF5表示至少包括同種型2、3或4的其他同種型。
[0024] 術語"可藥用的鹽"是指不是生物學或其它方面不期望的鹽。可藥用的鹽包括酸 和堿加成鹽。
[0025] 術語"可藥用的酸加成鹽"表示與無機酸（如鹽酸，氫溴酸，硫酸，硝酸，碳酸，磷 酸），和選自脂肪族，環脂族，芳族，araliphatic，雜環，羧酸的有機酸，和有機酸的磺酸類 (如甲酸，乙酸，丙酸，乙醇酸，葡糖酸，乳酸，丙酮酸，草酸，蘋果酸，馬來酸，丙二酸，琥珀酸， 富馬酸，酒石酸，檸檬酸，天冬氨酸，抗壞血酸，谷氨酸，鄰氨基苯甲酸，苯甲酸，肉桂酸，扁桃 酸，撲酸，苯乙酸，甲磺酸，乙磺酸，對甲苯磺酸和水楊酸）形成的那些可藥用的鹽。
[0026] 術語"可藥用的堿加成鹽"是指與有機堿或無機堿形成的那些可藥用的堿。可用 的無機堿的實例包括鈉，鉀，銨，鈣，鎂，鐵，鋅，銅，錳和鋁鹽。從可藥用的有機無毒堿衍生的 鹽包括伯，仲和叔胺的鹽，取代的胺包括天然存在的取代胺的鹽，環胺和堿離子交換樹脂如 異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二乙基氨基乙醇、trimethamine、二環 己基胺、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、咖啡因、普魯卡因、海巴明、膽堿、甜菜堿、乙二胺、葡糖胺、 甲基葡糖胺、可可堿、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶和聚胺樹脂的鹽。
[0027] 術語"藥物組合物"和"藥物制劑"（或"制劑"）可互換使用，表示這樣形式的制劑， 其形式允許包含在其中的活性成分的生物學活性是有效的，并且其不含有對施用該藥物組 合物的對象有不可接受的毒性的另外成分。
[0028] "液體組合物"是指在大氣壓下、在至少約2至約8°C的溫度下是水性或液體的組 合物。
[0029] 術語"凍干"是指通過升華和/或蒸發至不支持生物或化學反應的水平來冷凍物 質并然后降低水濃度的方法。
[0030] 術語"凍干的組合物"（或"凍干組合物（lyocomposition) "）表示通過液體組合 物的凍干方法獲得的或可獲得的組合物。通常其是具有小于5%的水含量的固體組合物。
[0031] 術語"重構的組合物"是指表示與重構介質組合的凍干的組合物，所述重構介質促 進了凍干的組合物的溶解。重構介質的例子包括，但不限于，注射用水（WFI)、抑菌性注射用 水（BWFI)、氯化鈉溶液（例如0· 9% (w/v)NaCl)、葡萄糖溶液（如5%葡萄糖）、包括表面活 性劑（例如〇· 01 %聚山梨醇酯20)的溶液或pH-緩沖液（如磷酸鹽緩沖液）。
[0032] 術語"無菌的"是指具有被微生物污染的概率小于10e-6的組合物或賦形劑。
[0033] 術語"可藥用的"是指在制備藥物組合物中有用的物質的屬性，所述物質通常是安 全，無毒的，并且不是生物學上或其它方面不期望的，并且對獸醫以及人類藥物用途是可以 接受的。
[0034] 術語"可藥用的賦形劑"，"可藥用的載體"和"治療上惰性的賦形劑"可以互換使 用，其指藥物組合物中不具有治療活性并且對施用的對象是無毒的任何可藥用的成分，如 在配制藥物產品中使用的崩解劑，粘合劑，填料，溶劑，緩沖劑，張力劑，穩定劑，抗氧化劑， 表面活性劑，載體，稀釋劑或潤滑劑。
[0035] 術語"半數最大抑制濃度"（IC50)是指在體外獲得抑制50%生物過程所需的 特定化合物或分子的濃度。IC50值可對數轉換為pIC 50值（-log IC50)，其中數值越 高指數地表示效力更大。IC50值不是絕對值，而是取決于實驗條件如使用的濃度。使用 Cheng-Prusoff 方程（Biochem. Pharmacol. (1973)22 :3099) IC50 值可以被轉換為絕對抑制 常數（Ki)。
[0036] "自體免疫性疾病"是指從個體自身組織產生并且針對個體自身組織的非惡性疾 病或病癥。自體免疫性疾病在本文中明確排除惡性或癌性疾病或病癥，特別是不包括B細 胞淋巴瘤，急性淋巴細胞白血病（ALL)，慢性淋巴細胞白血病（CLL)，毛狀細胞白血病和慢 性成髓細胞白血病。自體免疫性疾病或病癥的實例包括，但不限于，炎性反應，如包括銀肩 病和皮炎（例如特應性皮炎）的炎癥性皮膚病；系統性硬皮病和硬化癥；與炎性腸疾病（如 克羅恩氏病和潰瘍性結腸炎）相關的反應；呼吸窘迫綜合征（包括成人呼吸窘迫綜合癥； ARDS);皮炎；腦膜炎；腦炎；葡萄膜炎；結腸炎；腎小球腎炎；變應性病癥如濕瘆和哮喘，和 涉及T細胞浸潤和慢性炎癥反應的其它病癥；動脈粥樣硬化；白細胞粘附缺陷；類風濕性 關節炎；系統性紅斑狼瘡（SLE)(包括但不限于狼瘡腎炎，皮膚狼瘡）；糖尿病（例如I型 糖尿病或胰島素依賴型糖尿病）；多發性硬化癥；雷諾氏綜合征；自體免疫性甲狀腺炎；橋 本氏甲狀腺炎；過敏性腦脊髓炎；干燥綜合征；青少年發病型糖尿病；和與急性和遲發性超 敏反應相關的免疫反應，其由通常出現在結核病、結節病、多發性肌炎、肉芽腫和血管炎中 的細胞因子和T淋巴細胞介導；惡性貧血（阿狄森氏病）；涉及白細胞滲出的疾病；中樞神 經系統（CNS)炎性病癥；多器官損傷綜合征；溶血性貧血（包括但不限于冷沉球蛋白血癥 (cryoglobinemia)或庫姆斯陽性貧血）；重癥肌無力；抗原-抗體復合物介導的疾病；抗腎 小球基底膜病；抗磷脂綜合征；過敏性神經炎；Graves'病；Lambert-Eaton肌無力綜合征； 大皰性類天皰瘡；天皰瘡；自體免疫性多發性內分泌疾病；Reiter氏病；僵人綜合征；白塞 氏病；巨細胞動脈炎；免疫復合物腎炎；IgA