專利名稱：肽-脂構造及其在診斷和治療用途中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及在細胞和多細胞結構表面表達的肽水平中實現性質和數量改變的方 法，和用于這種方法的構造。特別地，本發明涉及用于診斷和治療用途的肽-脂構造，所述用途包括血清診斷。
背景技術：
在細胞和多細胞結構表面表達的肽水平中實現性質和數量改變的性能可供許多 診斷和治療之用。表面表達的肽水平的性質和數量改變可以改變跨膜轉運，細胞_溶質和細胞_細 胞相互作用，并由此改變該改性細胞或者多細胞結構的功能。已知的引起這種改變的方法包括基因操縱、內源性膜肽的化學修飾和使用脂錨著 點如GPI的“細胞表面涂料”。國際申請PCT/NZ2005/000052(公開號WO 2005/090368)的說明書描述了水溶性 碳水化合物-脂構造的制備，其用于在細胞和多細胞結構表面表達的碳水化合物水平中實 現性質和數量改變。國際申請PCT/NZ2005/000245(公開號WO 2007/035116)的說明書描述了另一種 制備水溶性碳水化合物-脂構造的方法，其中該碳水化合物是透明質酸聚合物。描述了該 構造用于改變胚胎和促進子宮內膜細胞結合。相對少的工作已經進行于肽作為單一組分的位點導向耦合至磷脂，之后它們合并 入自組裝結構如脂質體，或者需要提供肽-脂結構用于在細胞和多細胞結構表面表達的肽 水平中實現性質和數量改變的方法中。對于肽共價耦合至脂質體表面，許多標準技術已有描述。Martin等(1990)回顧了將包括肽的部分附著至脂質體表面的方法。Blume等(1993)描述了用Kung和Redemann (1986)描述的方法將水溶性的Glu-血 纖蛋白溶酶原耦合至脂質體。化學物質ECDia-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺 鹽酸酯)被用于在用Glu-血纖蛋白溶酶原培育活化脂質體懸浮液之前激活脂質體。提 供了 Glu-血纖蛋白溶酶原共價附著于二硬脂醇磷脂酰乙醇胺(DSPE)-PEG-COOH末端的 Proteo-PEG-包衣的脂質體。Haselgrubler等(1995)描述了一種異型雙功能交聯劑，用于促進免疫脂質體的 制備。該交聯劑由聚(乙二醇)(PEG，平均分子量800道爾頓(ISmer))的二胺衍生物合成。 該交聯劑具有官能團2-(吡啶基硫)丙酰基(PDP)和N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS)。Ishida等(2001)描述了帶有聚乙二醇耦合鐵傳遞蛋白的脂質體的制備。鐵傳遞 蛋白通過DSPE-PEG-C00H的末端羧基殘基結合。該脂質體被認為在體內化療劑或者質粒 DNA胞漿靶向至靶細胞中具有效用。Massaguer等(2001)描述了肽序列(GGRGRS)和疏水性衍生物結合至化學活化脂 質體的表面。該結合通過N-戊二酰二棕櫚酰基磷脂酰膽堿(NGPE)的羧基進行。
Massaguer等(2001)記錄了考慮到可能的體內用途，當無菌和簡易為某些首要需 求時，基于脂質體表面上化學反應，包括額外步驟的工藝可能較難擴大化至工業水平。鑒定 了肽序列的疏水性衍生物，以提供用于結合至脂質體表面的優化性質。Chimg等(2004)描述了合并入細胞膜的DOPE-PEG的抗原決定簇屏蔽效應，并推測 了脂質-PEG (n) (s)調節生物細胞響應的可能性，以及延伸此概念以在PEG鏈尾端引入官能 分子。Kato等(2004)描述了一種用于錨定高分子蛋白進入活哺乳動物細胞膜的方法。 與親水性聚(乙二醇)(PEG 80)偶合的二油醇磷脂酰乙醇胺(DOPE)被用作合成膜錨。肽 通過合成膜錨的氨基反應的N-羥基琥珀酰亞胺衍生物結合在PEG部分的末端。PEG80部分促進該合成膜錨在水中的溶解。Kato等(2004)記錄了如果該錨不溶 于水，不合需要和復雜化的工藝如脂質體制備和用該細胞膜融合脂質體可能是需要的，以 錨定軛合物入細胞膜。Kato等記錄的另一個優點是具有高親水_親油平衡值(歸因于高氧乙烯單元數 的PEG間隔團)的合成膜錨推斷為不具有細胞溶解活性。然而，在使用包括高氧乙烯單元 數的PEG間隔團的合成膜錨中出現困難。首先，共軛肽或者其它內源性細胞表面肽的表達可能被PEG間隔團屏蔽。其次，高 氧乙烯單元數的PEG間隔團可能引起蛋白質(包括某些個體的抗體)的非特異性粘附和/ 或補體級聯反應的非特異性活化。Winger等(1996)描述了溴乙酰化DSPE與硫醇結尾的十肽的共軛結合，所述十肽 在其C-末端包括極小人凝血酶-受體肽激動劑(HS-—SerPheLeuLeuArgAsn)。Hashimoto等(1986)描述了碘乙酰化DSPE與硫醇化化合物的共軛結合。需要有一種肽-脂構造，可用于在細胞和多細胞結構表面表達的肽水平中實現性 質和數量改變。本發明一個目的在于，提供滿足此需要的肽_脂構造，或者至少提供一種有用的 選擇。

發明內容
本發明的第一方面提供了一種檢測受試者血清中的反應抗體的方法，包括步驟 將血清樣品與細胞懸浮液接觸以提供一種混合物，所述細胞經過改性而合并結 構為(L-S-) ,F (-S-L) j的肽-脂構造； 在足夠容許凝集的溫度培育該混合物一段時間；和 測定該混合物中細胞的凝集度；其中F是包括用于反應性抗體的抗原決定簇的肽；S是共價連接F至L的間隔團；和L是選自二酰基_甘油酯或二烷基-甘油酯的脂質，包括甘油磷脂；和I和j各自為0或者1，任選地，該方法包括預備步驟 添加一定量的該肽至該血清的樣品；
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其中該肽的量足夠中和非特異凝集或者證實該反應性抗體的特異性。任選地，該方法包括中間步驟 在測定該混合物的細胞凝集度之前，添加抗_受試者球蛋白抗體至混合物。優選地，受試者是人類。優選地，該細胞是紅血球。優選地，該抗-受試者球蛋白抗體是抗_人類球蛋白(AHG)抗體。優選地，該反應性抗體相對于抗原呈反應性，所述抗原選自血型糖蛋白A，血型 糖蛋白B，或者其突變體(包括麗S血型系統)。選擇間隔團⑶，以提供水溶性的肽_脂構造。優選地，S是通過乙二醇的低聚物共價連接F至L的間隔團。優選地，該肽-脂構造的結構包括亞結構
其中M是一價陽離子(M+)，η是6至14，且*不為H。 更優選地，該肽_脂構造的結構是
(Xaa)xCys(Xaa).或者 其中M是一價陽離子(M+)，η是6至14，w是1或者2，χ和y的和大于5，ζ大于 5，且*不為H。優選地，i和j之和為1。任選地，F是肽，包括經過選擇以促進該肽溶解度的近端序列(PTS)。在一個優選的此方案中，該肽的PTS選自下組
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SerLysLysLysLysGlyAlaAlaAlaAlaGlySerGlySerGly優選地，F是包括抗原的抗原決定簇的肽，所述抗原選自血型糖蛋白A，血型糖蛋 白B，或者其突變體(包括麗S血型系統)。更優選地，F是選自肽目錄的肽。
最優選地，F是選自下組的肽GlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrAlaAlaAlaAlaAlaCysGlnThrAsnAspLysHisLysArRAspThrTyrGlySerGlySerGlyCysGlnThrAsnAspMetHisLysArRAspThrTyrGlySerGlySerGlyCysSerSerGlnThrAsnAspLysHisLysArRAspThrTyrCysThrTyrProAlaHisThrAlaAsnGluValCisProAlaHisThrAlaAsnGluValCysSerGlnThrAsnAspLysHisLysArrAspCysAlaAlaAlaAlaValMetTyrAlaSerSerGlyGlySerGlySerGlyValMetTyrAlaSerSerGly優選地，L是甘油磷酯。更優選地，L是選自下組的甘油磷酯1，2-0_ 二油酰 基-sn-丙三氧基-3-磷酯酰乙醇胺(DOPE)和1，2_0_ 二硬脂酰基-sn-丙三氧基_3_磷酯 酰乙醇胺(DSPE)。優選地，該肽_脂構造是本發明第二或者第三方面的示范性實施方式。本發明第二方面提供一種肽_脂構造，其結構為L-S-F其中F 是肽；S是通過乙二醇低聚物共價連接F至L的間隔團；和L是脂，選自二酰基_甘油酯和二烷基_甘油酯組成的組，包括甘油磷脂。優選地，該肽-脂構造的結構包括亞結構 其中M是一價陽離子(M+)，η是6至14，且*不為H。任選地，F是肽，包括經過選擇以促進該肽溶解度的近端序列(PTS)。在一個優選的此方案中，該肽的PTS選自下組SerLysLysLysLysGlyAlaAlaAlaAlaGlySerGlySerGly
優選地，該肽的末端序列選自下組GlyLysLysLysLysSerCysAlaAlaAlaAlaCysGlySerGlySerGlyCysCysSerLysLysLysLysGlyCysAlaAlaAlaAlaCysGlySerGlySerGly優選地，S通過該肽的&殘基形成的硫醚鍵共價連接至F。更優選地，S在該肽的未端或者接近末端處通過該肽的殘基形成的硫醚鍵共 價連接至F。最優選地，S在該肽的羧基未端通過該肽的殘基形成的硫醚鍵連接至F。間隔團⑶具有結構S1-S2-S3,且經過選擇以提供水溶性的肽_脂構造。S1是乙二 醇的低聚物。
優選地，S2-S3選自下組


其中R1是S1的未端碳，R2是M殘基的硫，且W是1或者2。 優選地，該肽_脂構造的結構為
(Xaa)xCys(Xaa)y
其中M是一價陽離子(M+)，η是6至14，w是1或者2，χ和y之和大于5，且*不 為H。更優選地，η是6。最優選地，y是0。優選地，F是包括抗原的抗原決定簇的肽，所述抗原選自血型糖蛋白A，血型糖蛋 白B，或者其突變體(包括麗S血型系統)。更優選地，F是選自肽目錄的肽。最優選地，F是選自下組的肽GlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrAlaAlaAlaAlaAlaCysGlnThrAsnAspLysHisLysArRAspThrTyrGlySerGlySerGlyCysGlnThrAsnAspMetHisLysArRAspThrTyrGlySerGlySerGlyCysSerSerGlnThrAsnAspLysHisLysArRAspThrTyrCys
ThrTyrProAlaHisThrAlaAsnGluValCisProAlaHisThrAlaAsnGluValCysSerGlnThrAsnAspLysHisLysArgAspC^s優選地，L是甘油磷酯。更優選地，L是選自下組的甘油磷酯1，2-0_ 二油酰 基-sn-丙三氧基-3-磷酯酰乙醇胺(DOPE)和1，2_0_ 二硬脂酰基-sn-丙三氧基_3_磷酯 酰乙醇胺(DSPE)。


)。
本發明第二方面的第一示范性實施方式提供了一種肽-脂構造，具有下列結構
GlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrAlaAlaAlaAlaAlaCy^
O, OO
CH3 (CH2) 7CHCH (CH2)s
O JOM6^^
CH3 (CH2)7CHCH(CH2)O
O
其中 M是一價陽離子(M+)，該構造命名為 DOPE-PEG6-β Ala-Mal-PTS-IMUTK) (Ml) 本發明第二方面的第二示范性實施方式提供了一種肽-脂構造，具有下列結構
GlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrGlySerGlySerGlyCys
OO0
CH3 (CH2)7CHCH (CH2) 3丫0^^。_^0_^Nf^(o^^NH^^ir
、OyOM
CH3 {CH2) 7CHCH (CH2) 3-η/0O
O
其中 M是一價陽離子(M+)，該構造命名為 DOPE-PEG6-β Ala-Mal-PTS-2MUTK) (M2) 本發明第二方面的第三示范性實施方式提供了一種肽-脂構造，具有下列結構
GlnThrAsnAspMetHisLysArgAspThrTyrGlySerGlySerGlyCy^
O
O
八NH
、O >OM
CH3 {CH2) 7CHCH {CH2) 3 γ0
CH3 (CH2) 7CHCH (CH2)
3Y
O
其中M是一價陽離子(M+)，該構造命名為DOPE-PEG6-β Ala-Mal-PTS-3MUTK(M3) 本發明第二方面的第四示范性實施方式提供了一種肽-脂構造，具有下列結構
SerSerGlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrCy^
〇O
CH3 (CH2) ,CHCH(CH2) 3丫一^^…^^^^^^/^” O^OM
CH3 {CH2) 7CHCH (CH2) 3丫0υ
O
其中 M 是一價陽離子(M+)，該構造命名為 DOPE-PEG6-β Ala-Mal-PTS-13MUTK(M13 本發明第二方面的第五示范性實施方式提供了一種肽-脂構造，具有下列結構
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其中M 是一價陽離子(M+)，該構造命名為 DOPE-PEG6-P Ala-Mal_PTS-18Mur(M18) (η = 6)。本發明第二方面的第六示范性實施方式提供了一種肽-脂構造，具有下列結構 其中M 是一價陽離子(M+)，該構造命名為 DOPE-PEG6-P Ala-Mal-PTS-2IMUTK (Μ21 )(η = 6)。本發明第二方面的第七示范性實施方式提供了一種肽-脂構造，具有下列結構 其中M 是一價陽離子(M+)，該構造命名為 DOPE-PEG6-β Ala-Mal-Hi 13 (M23) (η = 6)。本發明第二方面的第八示范性實施方式提供了一種肽-脂構造，具有下列結構 其中M 是一價陽離子(M+)，該構造命名為 DOPE-PEG6- β Ala-Mal-PTS-Milt (K, Μ)本發明第二方面的第九示范性實施方式提供了一種肽-脂構造，具有下列結構 其中M 是一價陽離子(Μ+)，該構造命名為 DOPE-PEG6-0Ala-Mal-Milt(K) (MOO),本發明第二方面的第十示范性實施方式提供了一種肽-脂構造，具有下列結構 其中M 是一價陽離子(M+)，該構造命名為 DOPE-PEG6- β Ala-Mal-Milt (M)。本發明第二方面的第十一示范性實施方式提供了一種肽_脂構造，具有下列結
構
其中M是一價陽離子(M+)，該構造命名為DOPE-PEG6- β Ala-Mal-Milt (K，Μ)。
本發明第三方面提供一種肽-脂構造，具有下列結構
L-S-F
其中
F是肽；
S是通過乙二醇低聚物共價連接F至L的間隔團；和 L是脂，選自二酰基_甘油酯和二烷基_甘油酯組成的組，包括甘油磷脂。 優選地，該肽_脂構造的結構為
其中M是一價陽離子(M+)，n是6至14，ζ大于5，且*不為H。更優選地，η是14t 任選地，F是肽，包括經過選擇以促進該肽的溶解度的末端序列。
在一個優選的此方案中，該肽的末端序列選自下組SerLysLysLysLysGlyAlaAlaAlaAlaGlySerGlySerGly優選地，F是選自下組的肽(Xaa) ,ValMetTyrAlaSerSerGly ；其中ζ是整數4，5或者6。優選地，F是選自下組的肽SerLysLysLysLysGlyValMetTyrAlaSerSerGlyAlaAlaAlaAlaValMetTyrAlaSerSerGlyGlySerGlySerGlyValMetTyrAlaSerSerGly優選地，L是甘油磷酯。更優選地，L是選自下組的甘油磷酯1，2-0_ 二油酰 基-sn-丙三氧基-3-磷酯酰乙醇胺(DOPE)和1，2_0_ 二硬脂酰基-sn-丙三氧基_3_磷酯 酰乙醇胺(DSPE)。本發明第三方面的第一示范性實施方式提供了一種肽-脂構造，具有下列結構 其中M是一價陽離子(M+)，該構造命名為DOPE-PEG14-Sypht5本發明第四方面提供一種制備本發明第二方面的肽-脂構造(F-S-L)的方法，包 括步驟 通過將馬來酰亞胺基供體試劑與結構為L-S1-NH2的前體構造反應，制備前體構 造的馬來酰亞胺基衍生物；和 將該前體構造的馬來酰亞胺基衍生物與包括Cys殘基且溶解于溶劑中的肽(F) 反應。其中L是脂，選自二酰基_甘油酯和二烷基_甘油酯組成的組，包括甘油磷脂；和S1選自乙二醇的低聚物組成的組。優選地，該肽-脂構造的結構為 其中η是6至14，w是1或者2，χ和y之和大于5，且*不為H。優選地，該馬來酰亞胺基供體試劑選自下組馬來酰亞胺丁酸的N-氧琥珀酰亞胺 酯；和馬來酰亞胺丙酸的N-氧琥珀酰亞胺酯。優選地，S1是乙二醇的低聚物，選自6至14mer PEG (PEG6至PEG14)組成的組。最 優選地，S1是PEG6。優選地，該溶劑選自下組三氟乙醇；DMSO ；或者其混合物。優選地，該Cys殘基是末端Cys殘基。任選地，F是肽，包括經過選擇以促進該肽在反應溶劑中溶解度的近端序列 (PTS)。在一個優選的此方案中，該肽的PTS選自下組SerLysLysLysLysGlyAlaAlaAlaAlaGlySerGlySerGly優選地，該肽的末端序列選自下組GlyLysLysLysLysSerCysAlaAlaAlaAlaCysGlySerGlySerGlyCysCysSerLysLysLysLysGlyCysAlaAlaAlaAlaCisGlySerGlySerGly優選地，F是選自肽目錄的肽。優選地，F是選自下組的肽GlnThrAsnAspLysHisLysArRAspThrTyrAlaAlaAlaAlaAlaCysGlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrGlySerGlySerGlyCysGlnThrAsnAspMetHisLysArRAspThrTyrGlySerGlySerGlyCysSerSerGlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrCysThrTyrProAlaHisThrAlaAsnGluValCysProAlaHisThrAlaAsnGluYalCysSerGlnThrAsnAspLysHisLysArgAspCys優選地，L是甘油磷酯。更優選地，L是選自下組的甘油磷酯1，2-0_ 二油酰 基-sn-丙三氧基-3-磷酯酰乙醇胺(DOPE)和1，2_0_ 二硬脂酰基-sn-丙三氧基_3_磷酯 酰乙醇胺(DSPE)。本發明的第五方面提供了一種在細胞和多細胞結構表面表達的肽水平中實現性 質和數量改變的方法，包括步驟 將該細胞或者多細胞結構與本發明第二或者第三方面的肽-脂構造的某一濃 度的溶液接觸，接觸時間和溫度足以容許該構造合并入該表面。優選地，該肽-脂構造是本發明第二方面的構造。優選地，該細胞或者多細胞結構選自下組紅血細胞；和胚胎。更優選地，該細胞 或者多細胞結構是人類細胞或者多細胞結構。
優選地，該時間和溫度不大于37°C下2小時或者4°C下24小時。本發明的所有方面中，M典型地為H，但是可以被另一種一價陽離子例如Na+，K+或 者NH4+取代。在說明書和權利要求書中，以下縮寫、短語和術語具有下列含義“診斷標記物”指一種分子，其在受試者體液中的存在對于受試者的顯型或者病理 性狀況有診斷意義。“MNS血型系統”指血型抗原或者那些抗原和突變體的抗原決定簇，其存在于任何 一種血型糖蛋白A、血型糖蛋白B或者導致血型糖蛋白A/B雜化的突變體之上。“近端序列”指鄰近該肽(F)的氨基_或者羧基_未端的一部分肽序列。“ RBC ”指紅血細胞。“反應性抗體”指一種免疫球蛋白，其在受試者體液中的存在對于受試者的顯型或 者病理性狀況有診斷意義。“通過乙二醇的低聚物”指由2至32mer組成的乙二醇的聚合物，特別排除通過由 大于32mer組成的乙二醇的聚合物。“水溶性的”指在不存在有機溶劑或者洗滌劑的情況下，該構造與水或者鹽水(例 如PBS)在至少100yg/ml的濃度接觸時，形成穩定的單相系統，短語“水可分散的”具有相 同含義。參考隨附的圖頁中的附圖，以下將詳細描述本發明的示范性實施方式。


圖 1、命名為 DOPE-PEG6-β Ala-Mal-Milt(K) (Μ13)的肽-脂構造的1H-WR譜(5mg/ ml 于 CD30D/CDCl3/D20/0· 5M CF3COOD 60/20/10/1 中，600MHz，30°C，δ ppm)。圖 2、命名為 DOPE-PEG6-P Ala-Mal-Milt(K) (M13)的肽-脂構造的 MALDI TOF 質譜 (2856 肽-D0PE(M+H) ；2878 肽-DOPE(M+Na) ；2894 肽-DOPE(M+K) ；2900 肽 _D0PE(M+Na， Na 鹽)；2916 肽-DOPE (M+K，Na 鹽))。圖 3、命名為 DOPE-PEG6-P Ala-Mal-Milt(K) (M13)的肽-脂構造的肽 SerSerGlnT hrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrGlySerGlySerGlyCis 的 ESI 質譜和 HPLC 分析。圖 4、命名為 DOPE-PEG6-P Ala-Mal-Milt(K) (M13)的肽-脂構造的肽 SerSerGlnT hrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrGlySerGlySerGlyCis 的 1H-NMR 譜(4. 5mg/ml 于 D2O 中， 600MHz, 30 °C, δ ppm)。圖5、通過將胚胎與M2肽-脂構造分散體在lmg/ml濃度接觸2小時，以合并該構 造而改性的無透明帶(zona free)胚胎的顯微照片。上面的顯微照片是DIC圖像。下面的 顯微照片是熒光圖像，顯示3. 0+熒光性。發明詳述總體而言，本發明提供具有結構(L-S-hFGS-Dj的肽-脂構造，其中F 是肽； S是共價連接F至L的間隔團；L是脂，選自二酰基_甘油酯和二烷基_甘油酯組成的組，包括甘油磷脂；i和j各自是0或者1;
以及這些肽_脂構造在診斷和治療用途中的應用。當i是0，j是1時，該肽-脂構造具有結構F-S-L當i是1，j是0時，該肽-脂構造具有結構L-S-F當S通過該肽的氨基未端連接至F時，該構造由結構或者亞結構L-S-F表示。當S通過該肽的羧基未端連接至F時，該構造由結構或者亞結構F-S-L表示。當S通過由該肽的Cys殘基的巰基形成的硫醚鍵連接至F時，該殘基以加下劃線 識別(Qis)。當S通過由該肽的一個或多個Cys殘基形成的硫醚鍵連接至F時，由結構 L-S-F-S-L，L-S-F或者F-S-L表示的該肽-脂構造不意味著硫醚鍵唯一地由末端Cys殘基 形成。參照包括以下亞結構的構造的應用，說明了該肽_脂構造在診斷用途中的應用 其中M是一價陽離子(M+)，n是6至14，*不為H。該肽選自由肽目錄所含的肽組 成的肽組，其提供于下文中，其中ζ是從0至6的整數。
根據2010年12月15日 申請日期2008年9月11日 優先權日2007年9月11日
發明者克里斯蒂娜-西蒙娜·溫伯格, 尼喬萊·博溫, 斯蒂芬·邁克爾·亨利 申請人:科德生物工程有限公司