專利名稱：：體內摻入非天然氨基酸的正交翻譯組分的制作方法
技術領域：
：本發明屬于翻譯生物化學領域。本發明涉及利用正交(orthogonal)tRNA、正交氨酰-tRNA合成酶及正交tRNA/正交氨酰-tRNA合成酶對將非天然氨基酸摻入蛋白質的組合物和方法。本發明還涉及用這種對在細胞內產生蛋白質的方法以及用這種方法產生的蛋白質。
背景技術：
：在歷史上，對蛋白質結構和功能的研究依賴于利用天然氨基酸反應活性基團的特性和可得到的反應化學物質。不幸的是，從細菌到人類，每種己知生物(的蛋白質)都是由相同的二十種常見氨基酸編碼的(罕見的例外是硒代半胱氨酸(參見，例如，A.Bock等，(1991),MolecularMicrobiology5:515-20)和卩比咯賴氨酸(參見，例如，G.Srinivasan等，(2002)，Science296:1459-62)。R-基團的這種有限選擇性限制了對蛋白質結構和功能的研究，所述研究經天然氨基酸的化學特性證實，例如，用天然氨基酸制備高度靶向(某氨基酸)的蛋白質修飾而不靶向蛋白質中所有其它氨基酸的能力有限。此外，天然氨基酸的功能活性，如突光、金屬螯合、氧化還原電勢、光囚禁(photocaging)等能力也有限。本領域目前使用的用于選擇性修飾蛋白質的修飾反應大多數涉及在親核和親電子反應伴侶之間形成靶向蛋白質氨基酸側鏈中天然發生的親核殘基的共價鍵，例如，a-鹵代酮與組氨酸或半胱氨酸側鏈的反應。這些情況下中的選擇性由蛋白質中親核殘基的數目和可達性決定。不幸的是，天然發生的蛋白質通常含有弱定位的(例如，不可接觸的)反應位點或多個反應靶點(例如，賴氨酸、組氨酸和半胱氨酸殘基)，這導致修飾反應的選擇性弱、難以通過親核/親電子試劑制造高度尋靶的蛋白質修飾。此外，修飾位點通常限于賴氨酸、組氨酸或半胱氨酸天然發生的親核側鏈。其它位點的修飾是困難的或不可能的。本領域需要的是將非天然氨基酸摻入蛋白質以便修飾和研究蛋白質結構和功能的新的策略，其中所述非天然氨基酸具有未在天然發生的氨基酸中發現的新的特性，例如，生物特性。這的確是本領域的需要，以便產生以高度選擇性方式修飾蛋白質以及在生理條件下修飾蛋白質的蛋白質修飾反應的新的策略。本領域需要的是產生蛋白質修飾的新方法，其中所述修飾是高度特異的，例如，不便天然發生的氨基酸發生交叉反應或副反應的修飾。高度特異的蛋白質修飾策略的新化學可廣泛用于研究蛋白質的結構和功能。克服這些限制的ー個策略是擴展遺傳密碼并加入相比生物所有組成成分(repertoire)具有不同物理、化學或生物特性的氨基酸。這種方法已被證實是可行的，可利用宿主細胞如真細菌大腸埃希氏菌(大腸桿菌)、酵母或哺乳動物細胞的體內蛋白質生物合成機制通過正交tRNA和相應的新正交氨酰-tRNA合成酶將非天然氨基酸加入蛋白質。這種方法描述于各種資料，例如，Wang等，(2001),Science292=498-500；Chin等，(2002)JournaloftheAmericanChemicalSociety124:9026-9027;Chin和Schultz,(2002),ChemBioChem11:1135-1137;Chin等，(2002),PNASUnitedStatesofAmerica99:11020-11024;和Wang和Schultz，(2002),Chem.Comm.,l~10o也可參見題為“產生正交tRNA-氨酰-tRNA合成酶對的方法和組合物(METHODSANDCOMPOSITIONSFORTHEPRODUCTIONOFORTHOGONALTRNA-AMINOACYLTRNASYNTHETASEPARIS)”的國際公開WO2002/086075;題為“非天然氨基酸的體內摻入(INVIVOINCORPORATIONOFUNNATURALAMINOACIDS)”的WO2002/085923;題為“真核遺傳密碼的擴展(EXPANDINGTHEEUKARYOTICGENETICCODE)”的WO2004/094593;2004年7月7日提交的TO2005/019415；2004年7月7日提交的WO2005/007870;和2004年7月7日提交的WO2005/007624。本領域的確需要開發將非天然氨基酸摻入蛋白質的正交翻譯組分，其中所述非天然氨基酸能被摻入規定位置，且其中所述非天然氨基酸賦予摻入它們的蛋白質新的生物特性。還需要開發摻入非天然氨基酸的正交翻譯組分，所述非天然氨基酸具有能使該氨基酸成為特定修飾的靶以排除與蛋白質中其它位點的交叉反應或副反應的新化學特性。還特別需要能夠產生含有顯著量非天然氨基酸的蛋白質的蛋白質表達系統，所述含量能使該蛋白質用于治療用途和生物醫學研究。這里描述的本發明滿足了這些需要以及其它需要，通過以下描述這是顯而易見的。
發明內容本發明提供了在體內(例如在宿主細胞內)響應選擇者密碼子(selectorcodon)如琥珀密碼子將非天然氨基酸摻入產生的多肽鏈的組合物和方法。這些組合物包含不與宿主細胞翻譯機制相互作用的正交-tRNA(0-tRNA)和正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)對。這就是說，宿主細胞內源性氨酰-tRNA合成酶不會將任何氨基酸(天然或非天然)加入到0-tRNA中。類似地，本發明提供的O-RS不以顯著水平或者某些情況下是可檢測水平用氨基酸(天然或非天然)加載任何內源性tRNA。這些新的組合物能夠產生大量含有翻譯摻入的非天然氨基酸的蛋白質。根據所摻入非天然氨基酸的化學特性，這些蛋白質具有廣泛用途，包括例如用于治療或生物醫學研究。ー些方面，本發明提供了一種翻譯系統。這些系統包含第一正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)、第一正交tRNA(0-tRNA)和非天然氨基酸，其中所述第一O-RS用第一非天然氨基酸優先氨酰化第一0-tRNA。第一非天然氨基酸可選自P-こ基硫代羰基-L-苯丙氨酸、P-(3-氧代丁酰基)-L-苯丙氨酸、1，5-丹酰-丙氨酸、7-氨基-香豆素-丙氨酸、7-羥基-香豆素-丙氨酸、O-硝基芐基-絲氨酸、0-(2-硝基芐基)-L-酪氨酸、P-羧甲基-L-苯丙氨酸、m-氰基-L-苯丙氨酸、P-氰基-L-苯丙氨酸、聯苯基丙氨酸、3-氨基-L-酪氨酸、聯批唳基丙氨酸、P-(2-氨基-I-輕こ基)-L-苯丙氨酸或p-異丙基硫代擬基-L-苯丙氨酸。該翻譯系統可采用衍生自各種來源的組分。一實施方案中，第一O-RS衍生自詹氏甲燒球菌(Methanococcusjannaschii)氨酰-tRNA合成酶,例如,野生型詹氏甲燒球菌酪氨酰-tRNA合成酶。在其它實施方案中，O-RS衍生自大腸桿菌氨酰-tRNA合成酶，例如，野生型大腸桿菌亮氨酰-tRNA合成酶。用于該系統的O-RS包含選自以下的氨基酸序列SEQIDN0:12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、50、52-54、57、59-63以及那些序列的保守變體。一些實施方案中，0-tRNA是琥珀抑制基因tRNA。一些實施方案中，0-tRNA包含SEQIDNO:I或2或由其編碼。ー些方面，翻譯系統還包含編碼感興趣蛋白質的核酸，其中所述核酸包含至少ー種被所述0-tRNA識別的選擇者密碼子。ー些方面，翻譯系統包含利用第二非天然氨基酸的第二正交對(即第二O-RS和第ニ0-tRNA)，從而該系統現在能夠在多肽的不同選定位置摻入至少兩個不同的非天然氨基酸。在這種雙重系統中，第二O-RS用不同于第一非天然氨基酸的第二非天然氨基酸優先氨酰化第二0-tRNA，且第二0-tRNA識別不同于被第一0-tRNA識別的選擇者密碼子的選擇者密碼子。一些實施方案中，翻譯系統位于宿主細胞中(并包括宿主細胞)。對所用宿主細胞沒有特別限制，只要O-RS和0-tRNA在它們的宿主細胞環境中保留它們的正交性即可。所述宿主細胞可以是真細菌細胞如大腸桿菌，或酵母細胞如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。所述宿主細胞可含有一種或多種編碼包括O-RS或0-tRNA在內的該翻譯系統組分的多核苷酸。一些實施方案中，編碼O-RS的多核苷酸包含SEQIDN0:13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、51、56或58的核苷酸序列。本發明還提供了產生在所選位置上含有ー個或多個非天然氨基酸的蛋白質的方法。這些方法利用上述翻譯系統。通常，這些方法開始于提供翻譯系統的步驟，所述翻譯系統包含(i)選自以下的第一非天然氨基酸P-こ基硫代羰基-L-苯丙氨酸、P-(3-氧代丁酰基)-L-苯丙氨酸、I,5-丹酰-丙氨酸、7-氨基-香豆素-丙氨酸、7-羥基-香豆素-丙氨酸、O-硝基芐基-絲氨酸、0-(2-硝基芐基)-L-酪氨酸、P-羧甲基-L-苯丙氨酸、m-氰基-L-苯丙氨酸、p-氰基-L-苯丙氨酸、聯苯基丙氨酸、3-氨基-L-酪氨酸、聯批唳基丙氨酸、p-(2-氨基-I-輕こ基)-L-苯丙氨酸和p-異丙基硫代擬基-L-苯丙氨酸；(ii)第一正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)；(iii)第一正交tRNA(0-tRNA)，其中所述O-RS用非天然氨基酸優先氨酰化0-tRNA;和(iv)編碼所述蛋白質的核酸，其中所述核酸包含至少ー種被所述第一0-tRNA識別的選擇者密碼子。該方法然后在所述蛋白質的翻譯過程中響應所述選擇者密碼子將所述非天然氨基酸摻入所述蛋白質的所述所選位置，從而產生在所選位置含有所述非天然氨基酸的所述蛋白質。該方法可用各種試劑和步驟廣泛采用。一些實施方案中，提供了編碼O-RS的多核苷酸。一些實施方案中，提供了衍生自詹氏甲烷球菌氨酰-tRNA合成酶的0-RS，例如可提供野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰-tRNA合成酶。在其它實施方案中，提供了衍生自大腸桿菌氨酰-tRNA合成酶的0-RS，例如可提供衍生自野生型大腸桿菌亮氨酰-tRNA合成酶的0-RS。一些實施方案中，提供步驟包括提供含有以下氨基酸序列的O-RS:SEQIDN0:12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、50、52-55、57、59-63所示氨基酸序列及其保守變體。在這些方法的一些實施方案中，提供翻譯系統的步驟包括通過定點誘變突變野生型氨酰-tRNA合成酶的氨基酸結合口袋，并選擇用所述非天然氨基酸優先氨酰化所述Ο-tRNA的所得0-RS。所述選擇步驟包括在定點誘變之后從含有許多所得氨酰-tRNA合成酶分子的集合中對所述O-RS進行陽性選擇和陰性選擇。一些實施方案中，提供步驟提供編碼Ο-tRNA的多核苷酸，例如，Ο-tRNA是琥珀抑制基因tRNA，或者Ο-tRNA包含SEQIDNO:I或2所示多核苷酸序列或由其編碼。在這些方法中，提供步驟還包括提供含有被翻譯系統利用的琥珀選擇者密碼子的核酸。還可修飾這些方法以在蛋白質中摻入一個以上非天然氨基酸。在那些方法中，與第一翻譯系統結合使用第二正交翻譯系統，其中的第二系統具有不同的氨基酸和選擇者密碼子特異性。例如，提供步驟可包括提供第二O-RS和第二Ο-tRNA，其中的第二O-RS用不同于第一非天然氨基酸的第二非天然氨基酸優先氨酰化第二Ο-tRNA，且其中的第二0-tRNA識別核酸中不同于被第一Ο-tRNA識別的選擇者密碼子的選擇者密碼子。產生具有非天然氨基酸的蛋白質的方法還可在宿主細胞內進行。此時需提供宿主細胞，其中的宿主細胞含有非天然氨基酸、0-RS、Ο-tRNA和核酸，且其中所述培養所述宿主細胞導致非天然氨基酸的摻入。一些實施方案中，提供步驟包括提供真細菌宿主細胞(例如，大腸桿菌)或酵母宿主細胞。一些實施方案中，提供步驟包括提供含有編碼O-RS的多核苷酸的宿主細胞。例如，編碼O-RS的多核苷酸可包含SEQIDN0:13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、51、56或58所示的核苷酸序列。一些實施方案中，提供翻譯系統的步驟通過提供細胞提取物完成。一些方面，本發明提供了翻譯系統，該系統用于摻入3-硝基-L-酪氨酸或P-硝基-L-苯丙氨酸。這些系統包含第一正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)、第一正交tRNA(Ο-tRNA)和非天然氨基酸,其中的第一O-RS用第一非天然氨基酸優先氨酰化第一Ο-tRNA,其效率至少為含有所述第一非天然氨基酸、所述第一Ο-tRNA和含有選自SEQIDNO7-10的氨基酸序列的O-RS的翻譯系統效率的50%。該翻譯系統可使用衍生自各種來源的組分。一些實施方案中，第一O-RS衍生自詹氏甲烷球菌氨酰-tRNA合成酶，例如，野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰-tRNA合成酶。用于該系統的O-RS可包含選自SEQIDN0:7-10所示氨基酸序列及其保守變體的氨基酸序列。一些實施方案中，Ο-tRNA是琥珀抑制基因tRNA。一些實施方案中，Ο-tRNA包含SEQIDNO:I所示多核苷酸序列或由其編碼。一些方面，翻譯系統還包含編碼感興趣蛋白質的核酸，其中所述核酸具有至少一個被Ο-tRNA識別的選擇者密碼子。一些方面，翻譯系統包含利用第二非天然氨基酸的第二正交對(即第二O-RS和第二Ο-tRNA)，從而該系統現在能夠在多肽的不同選定位置摻入至少兩個不同的非天然氨基酸。在這種雙重系統中，第二O-RS用不同于第一非天然氨基酸的第二非天然氨基酸優先氨酰化第二Ο-tRNA，且第二Ο-tRNA識別不同于被第一Ο-tRNA識別的選擇者密碼子的選擇者密碼子。一些實施方案中，翻譯系統位于宿主細胞中(并包括宿主細胞)。對所用宿主細胞沒有特別限制，只要O-RS和Ο-tRNA在它們的宿主細胞環境中保留它們的正交性即可。所述宿主細胞可以是真細菌細胞如大腸桿菌。所述宿主細胞可含有一種或多種編碼包括O-RS或Ο-tRNA在內的該翻譯系統組分的多核苷酸。一些實施方案中，編碼O-RS的多核苷酸包含SEQIDNO:11的核苷酸序列。本發明還提供了產生在所選位置上含有一個或多個非天然氨基酸的蛋白質的方法。這些方法利用上述翻譯系統。通常，這些方法開始于提供含有翻譯系統的宿主細胞的步驟，所述翻譯系統包含(i)第一非天然氨基酸，其為3-硝基-L-酪氨酸或P-硝基-L-苯丙氨酸；(ii)第一正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)；(iii)第一正交tRNA(Ο-tRNA)，其中的O-RS用非天然氨基酸優先氨酰化Ο-tRNA，其效率至少為含有所述非天然氨基酸、Ο-tRNA和含有選自SEQIDNO7-10的氨基酸序列的O-RS的宿主細胞效率的50%;和(iv)編碼蛋白質的核酸，其中所述核酸含有至少一種被Ο-tRNA識別的選擇者密碼子。然后使宿主細胞生長，并在所述蛋白質的翻譯過程中響應選擇者密碼子將所述非天然氨基酸摻入所述蛋白質的所選位置，其中，所述蛋白質中的所選位置對應于所述核酸中所述選擇者密碼子的位置，從而產生在所選位置含有所述非天然氨基酸的所述蛋白質。這些方法可用各種試劑和步驟廣泛采用。一些實施方案中，提供了編碼O-RS的多核苷酸。一些實施方案中，提供了衍生自詹氏甲烷球菌氨酰-tRNA合成酶的0-RS，例如可提供野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰-tRNA合成酶。一些實施方案中，提供步驟包括提供含有選自SEQIDNO:7-10及其保守變體的氨基酸序列的0-RS。在這些方法的一些實施方案中，提供翻譯系統的步驟包括通過定點誘變突變野生型氨酰-tRNA合成酶的氨基酸結合口袋，并選擇用所述非天然氨基酸優先氨酰化所述Ο-tRNA的所得0-RS。所述選擇步驟包括在定點誘變之后從含有許多所得氨酰-tRNA合成酶分子的集合中對所述O-RS進行陽性選擇和陰性選擇。一些實施方案中，提供步驟提供編碼Ο-tRNA的多核苷酸，例如，Ο-tRNA是琥珀抑制基因tRNA，或者Ο-tRNA包含SEQIDNO:I所示多核苷酸序列或由其編碼。在這些方法中，提供步驟還包括提供含有被翻譯系統利用的琥珀選擇者密碼子的核酸。還可修飾這些方法以在蛋白質中摻入一個以上非天然氨基酸。在那些方法中，與第一翻譯系統結合使用第二正交翻譯系統，其中的第二系統具有不同的氨基酸和選擇者密碼子特異性。例如，提供步驟可包括提供第二O-RS和第二Ο-tRNA，其中的第二O-RS用不同于第一非天然氨基酸的第二非天然氨基酸優先氨酰化第二Ο-tRNA，且其中的第二0-tRNA識別核酸中不同于被第一Ο-tRNA識別的選擇者密碼子的選擇者密碼子。產生具有非天然氨基酸的蛋白質的方法還可在宿主細胞內進行。在這些實施方案中，宿主細胞含有非天然氨基酸、0-RS、Ο-tRNA和核酸，且其中所述培養所述宿主細胞導致非天然氨基酸的摻入。一些實施方案中，提供步驟包括提供真細菌宿主細胞(例如，大腸桿菌)或酵母宿主細胞。一些實施方案中，提供步驟包括提供含有編碼O-RS的多核苷酸的宿主細胞。例如，編碼O-RS的多核苷酸可包含SEQIDNO:11所示的核苷酸序列。一些實施方案中，提供翻譯系統的步驟通過提供細胞提取物完成。本發明還提供了各種包含核酸和蛋白質的組合物。對該組合物的性質沒有特別限制，只要該組合物含有規定的核酸或蛋白質。本發明的組合物可含有任何數量任何性質的額外組分。例如，本發明提供了含有O-RS多肽的組合物，其中所述多肽含有SEQIDNO:7-10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、50、52-55、57、59-63或其保守變體，其中的保守變體多肽用非天然氨基酸氨酰化同源正交tRNA(Ο-tRNA)，其效率至少為含有Ο-tRNA、非天然氨基酸和含有選自SEQIDNO:7_10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、50、52-54、57或59-63的氨基酸序列的氨酰-tRNA合成酶的翻譯系統效率的50%。本發明還提供了編碼上述任何多肽的多核苷酸。一些實施方案中，這些多核苷酸可含有SEQIDN0:ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、51、56和58。一些實施方案中，多肽在細胞中。本發明還提供了含有SEQIDNO:11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、51、56或58所示核苷酸序列的多核苷酸組合物。一些實施方案中，本發明提供了含有所述多核苷酸的載體，如表達載體。一些實施方案中，本發明提供了含有上述載體的細胞。圖I提供了各種非天然氨基酸的化學結構。圖2提供了在存在(泳道2)或不存在(泳道3)P-硝基-L-苯丙氨酸時累積的Z-結構域蛋白的染色SDS-PAGE分析照片。泳道I含有分子量標記。圖3提供摻入P-硝基-L-苯丙氨酸的Z-結構域蛋白的MALDI-T0F分析。預計質量7958，7826(第一個甲硫氨酸除外);觀察值:7958,7828。圖4A提供了22TrpGCMpl突變體(實線)以及22Trp和22p-硝基-L-苯丙氨酸GCMpl突變體混合物(虛線)的熒光光譜。圖4B提供了55TrpGCMpl突變體(實線)以及55Trp和22p-硝基-L-苯丙氨酸GCMpl突變體混合物(虛線)的熒光光譜。圖5A提供了1，5-丹酰丙氨酸的化學結構。圖5B提供了結合有1，5_丹酰丙氨酸-AMP-酰胺的嗜熱棲熱菌亮氨酰-tRNA合成酶(LRS)活性位點的模型。作為隨機化區域一部分的突變體LRS克隆B8的活性位點殘基用條狀物表示。編號與大腸桿菌LRS相對應。圖6A和6B描述了突變體B8亮氨酰-tRNA合成酶編輯位點的再設計策略。圖6A提供了與模擬荷電tRNA3’-末端的2’-(L-正纈氨酰)_氨基_2’-脫氧腺苷復合的嗜熱棲熱菌亮氨酰-tRNA合成酶編輯位點的晶體結構。T252和V340用條狀物表示。圖6B提供了Ni-NTA純化的hSOD的SDS-PAGE分析，它具有用亮氨酰-tRNA合成酶克隆B8在33位引入的丹酰丙氨酸和兩個突變體V338A和T252A。上面的凝膠是考馬斯染色的照片。下面的凝膠是在302nm激發、在520nm發射的突光圖象。L=分子量梯；UAA=非天然氨基酸。圖7A和7B描述了通過易錯PCR和選擇產生的大腸桿菌亮氨酰-tRNA合成酶克隆G2-6的增強的琥珀抑制效率。圖7A提供了嗜熱棲熱菌亮氨酰-tRNA合成酶的晶體結構(Cusack等，EMBOj.,19(10):2351-2361[2000])。標出了G2-6克隆中存在的合成結構域、編輯結構域、同源大腸桿菌合成酶中隨機化的氨基酸以及通過易錯PCR改變的氨基酸。圖7B提供了所表達的在33位含有ο-硝基芐基絲氨酸的hSOD的考馬斯染色SDS-PAGE分析，采用設計的可摻入ο-硝基芐基半胱氨酸的大腸桿菌亮氨酰-tRNA突變體合成酶克隆3H11和用ο-硝基芐基絲氨酸有效抑制所涉及的突變體大腸桿菌亮氨酰-tRNA合成酶克隆G2-6。L=分子量梯；UAA=非天然氨基酸(oNBS)。圖8提供了通過365nm照射將囚禁的酪氨酸分子0_(2_硝基芐基)_L_酪氨酸光致脫囚禁(photodecaging)(光活化)的示意圖，導致切斷芐基化CO-鍵和迅速形成脫囚禁的(decaged)氨基酸。圖9提供了濃度曲線試驗，說明了觀察到的囚禁中的(caged)酪氨酸分子O-(2-硝基芐基)-L-酪氨酸的光致脫囚禁(光活化)。O-(2-硝基芐基)-L-酪氨酸的光致脫囚禁可用手提UV燈(365nm，距離IOmm)照射O.2mM氨基酸水溶液證實。在特定時間點取出等份溶液用LC/MS分析。顯示了O-(2-硝基芐基)-L-酪氨酸(正方形)和相應的脫囚禁酪氨酸(圓形)的濃度。圖10提供了在存在或不存在O-(2-硝基芐基)-L-酪氨酸時用三種不同突變體合成酶表達的肌球蛋白74TAG的Gelcode藍染色的SDS-PAGE。圖IIA和IIB提供了74TAG突變體肌球蛋白的LC-MS/MS分析，顯示了74位的酪氨酸(胰蛋白酶(水解)肽HGVTVLTALGYILK;SEQIDN0:64)。圖12A和12B提供了與圖IlA和IlB類似的LC-MS/MS分析，但分析使用氚化的0-(2-硝基芐基)-L-酪氨酸，其中的J表示氚化的氨基酸(胰蛋白酶(水解)肽HGVTVLTALGJILK；SEQIDN0:65)。圖13提供了在THF和水中獲得的對-氰基苯丙氨酸IR譜的疊加圖。圖14A提供了與高斯曲線(虛線)擬合的對-氰基苯丙氨酸(實線)的本底減除譜。圖14B提供了與高斯曲線(虛線)擬合的間-氰基苯丙氨酸(實線)的本底減除譜。圖15提供了P-乙基硫代羰基-L-苯丙氨酸的合成過程。圖16提供了在第七個位置上含非天然氨基酸的突變體Z結構域蛋白的MALDI-T0F質譜分析結果。所有通過試驗獲得的質量數據與含有硫酯或羧酸基團的完整蛋白質的計算質量極好吻合。圖17提供了通過化學結合標記的蛋白質的原理圖。圖18A-18D提供了在340nm測得的LC/MS洗脫曲線(第一峰3;第二峰2)。圖18A顯示了使用3和2的1:1甲醇混合物得到的曲線。圖18B顯示了使用3的PBS溶液得到的曲線(pH=7.4，反應時間1周)。圖18C顯示了用3的PBS溶液得到的曲線(pH=3.9，反應時間4天)。圖18D顯示了用稀硫酸溶液稀釋的3得到的曲線(pH=1.9,反應時間12小時)。所有反應都在室溫下勻速攪拌進行。圖19提供了含有二酮基非天然氨基酸P-(3-氧代丁酰基)-L-苯丙氨酸的合成過程。圖20提供了在存在或不存在P-(3-氧代丁酰基)-L-苯丙氨酸時表達的Z結構域蛋白的Gelcode藍染色的SDS-PAGE分析。分析顯示了用熒光素酰肼體外標記含有p_(3_氧代丁酰基)-L-苯丙氨酸的突變體Z結構域蛋白。Wt=野生型。圖21提供了含有二酮基部分的各種加合物的合成過程。具體實施例方式定義在詳細描述本發明前，需要說明本發明并不局限于某些特定的生物系統，本發明可以有各種變化。還應當說明本文所用的術語是為了描述特定的實施方案，并不意味著對本發明的限制。如本發明的說明書和附屬權利要求中使用，除非特別指明，單數形式“一個”、“一種”和“這種”也包括復數。因此，例如，“一個細胞”包括兩個或多個細胞；“一種多核苷酸”作為一種特定物質包括該多核苷酸的多個拷貝。除了在此處和說明書的其余部分所定義的，本文所用的所有科技術語都與本發明所屬領域普通技術人員共同理解的意義相同。正交本文所用的術語“正交”指一種分子(如正交tRNA(Ο-tRNA)和/或正交氨酰tRNA合成酶(O-RS))具有某細胞內源性組分的功能，但與該細胞或翻譯系統內的相應內源性分子相比其效力低，或者不具有該細胞內源性組分的功能。就tRNA和氨酰-tRNA合成酶而言，正交是指正交的tRNA或正交的氨酰tRNA合成酶具有內源性tRNA或內源性tRNA合成酶的功能，但與內源性tRNA或內源性tRNA合成酶相比無能或效力低，如低于20%、10%、5%或1%。該正交分子缺乏細胞內內源性互補分子的正常功能。例如，與內源性tRNA被內源性RS氨酰化相比，細胞內的正交tRNA被細胞的內源性RS氨酰化時其效率降低，甚至為零。在另外一個實施例中，與內源性的RS氨酰化內源性tRNA相比，正交的RS在感興趣細胞內氨酰化任何內源性tRNA時其效率降低，或者甚至為零。第二正交分子可以被引入到細胞內和第一正交分子一起發揮功能。例如，正交tRNA/RS對包括引入的互補組分，在細胞內一起行使功能時其效率與對照，如相應的內源性tRNA/RS對或活性正交對(如酪氨酰正交tRNA/RS對)相比可以達到45%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、99%或更高。ιΗ交酪氨釀-tRNA:本文所用的術語正交酪氨酰-tRNA(酪氨酰-0_tRNA)是與感興趣翻譯系統正交的tRNA，該tRNA:(I)與天然產生的酪氨酰tRNA相同或基本類似，(2)衍生自天然酪氨酰tRNA的天然突變或人工誘變，(3)由考慮到(I)或(2)的野生型或突變型酪氨酰tRNA序列的方法所產生，(4)與野生型或突變型亮氨酰或酪氨酰tRNA同源，(5)與表5中所列稱為亮氨酰或酪氨酰tRNA合成酶底物的典型tRNA同源，或(6)是表5中稱為亮氨酰或酪氨酰tRNA合成酶底物的典型tRNA的保守變體。亮氨酰或酪氨酰tRNA可以負載一個氨基酸，或非負載狀態。還需要說明“酪氨酰-Ο-tRNA”或“亮氨酰-Ο-tRNA”可任選經相關合成酶加載(氨酰化)除賴氨酸或亮氨酸以外的氨基酸，如非天然氨基酸。應理解本發明的亮氨酰或酪氨酰-Ο-tRNA確實可優選用于在翻譯時響應選擇者密碼子將任何必需的氨基酸，無論是天然的或是人工合成的，插入到正在延伸的多肽內。IH交酪氨酰氨基酸合成酶本文所用的正交酪氨酰氨基酸合成酶(酪氨酰-0-RS)是一種可以在感興趣翻譯系統內用氨基酸優先氨酰化酪氨酰-Ο-tRNA的合成酶。被酪氨酰-O-RS加載到酪氨酰-Ο-tRNA上的氨基酸可以是任何氨基酸，無論是天然的還是人工合成的，不限于本文所述的。該合成酶還任選可以與天然的酪氨酰氨基酸合成酶相同或同源，或者與表5中稱為酪氨酰-O-RS的合成酶相同或同源。例如,酪氨酰-O-RS可以是表5所列的酪氨酰-O-RS的保守變體，和/或與表5所列的酪氨酰-O-RS的序列至少有50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或更高的相同性。類似地，正交亮氨酰氨基酸合成酶(亮氨酰-0-RS)是一種在感興趣翻譯系統內能用氨基酸優先氨酰化亮氨酰-Ο-tRNA的酶。被亮氨酰-O-RS加載到亮氨酰-Ο-tRNA上的氨基酸可以是任何氨基酸，無論是天然的還是人工合成的，不限于本文所述的。該合成酶還任選可以與天然的亮氨酰氨基酸合成酶相同或同源，或者與表5中稱為亮氨酰-O-RS的合成酶相同或同源。例如，該O-RS可以是表5所列的亮氨酰-O-RS的保守變體，和/或與表5所列的O-RS的序列至少有50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或更高的相同性。M^(cognate):術語“同源”指能一起發揮功能的組分，如正交tRNA和正交氨酰-tRNA合成酶。此種組分也稱為互補組分。優先氨釀化在這里渉及ιΗ交翻譯系統,當O-RS用氨基酸加載Ο-tRNA的效率比其加載表達系統中其它任何內源性tRNA的效率都高時O-RS“優先氨酰化”同源Ο-tRNA。也就是說，當Ο-tRNA和其它任何給定的內源性tRNA以大致相同摩爾比例同時存在于翻譯系統內時，O-RS加載Ο-tRNA的頻率要高于其加載內源性tRNA的頻率。優選的是當Ο-tRNA和內源性tRNA以相同摩爾濃度存在于翻譯系統內時，被O-RS所加載的Ο-tRNA與O-RS所加載的內源性tRNA的相對比例較高，其結果導致O-RS只加載、或者幾乎只加載Ο-tRNA。當Ο-tRNA和O-RS以相同摩爾濃度存在時，被O-RS加載的Ο-tRNA和內源性tRNA之間的相對比例大于1:1，優選至少約為2:1，更優選的是5:1，甚至10:1、20:1、50:1、75:1、95:1、98:1、99:1、100:1、500:1、1，000:1、5，000:1或更高。下述情況下所述O-RS“用非天然氨基酸優先氨酰化0-tRNA”(a)與內源性tRNA相比，O-RS更容易氨酰化Ο-tRNA，以及(b)與O-RS用任何天然氨基酸氨酰化Ο-tRNA相比，其中的氨酰化是非天然氨基酸特異性的。也就是說，當非天然氨基酸和天然氨基酸以等摩爾的量存在于含O-RS和Ο-tRNA的翻譯系統中時，O-RS用非天然氨基酸加載Ο-tRNA的頻率要高于用天然氨基酸加載Ο-tRNA的頻率。優選的是非天然氨基酸加載的Ο-tRNA與天然氨基酸加載的Ο-tRNA之間的相對比例較高。更優選的是O-RS只用或者幾乎只用非天然氨基酸加載Ο-tRNA。當非天然氨基酸和天然氨基酸以等摩爾的濃度存在于翻譯系統中時，非天然氨基酸加載的Ο-tRNA與天然氨基酸加載的Ο-tRNA之間的相對比例高于1:1，優選至少約為2:1，更優選的是5:1，甚至10:1、20:1、50:1、75:1、95:1、98:1、99:1、100:1、500:1、1,000:1,5,000:1或更高。詵擇者密碼子:術語“選擇者密碼子”指在翻譯過程中能被Ο-tRNA識別但通常不被內源性tRNA識別的密碼子。Ο-tRNA反密碼子環能識別mRNA上的選擇者密碼子并能在多肽的該位點摻入此氨基酸，例如非天然氨基酸。選擇者密碼子包括無義密碼子，如終止密碼子，例如琥珀密碼子、赭石密碼子和乳白密碼子；四堿基或多堿基密碼子；稀有密碼子’天然或非天然堿基對產生的密碼子等。抑制基因tRNA:抑制基因tRNA是一種可在給定的翻譯系統內改變信使RNA(mRNA)的閱讀的tRNA，例如通過將氨基酸摻入到多肽鏈內以響應選擇者密碼子的機制。例如，抑制基因tRNA可通讀終止密碼子(例如，琥珀、赭石或乳白密碼子)、四堿基密碼子、稀有密碼子坐寸ο抑制活件:如本文采用的，術語“抑制活性”通常指tRNA(如抑制基因tRNA)翻譯閱讀通過某密碼子(如為琥珀密碼子或四堿基或多堿基密碼子的選擇者密碼子)的能力，否則導致翻譯終止或錯譯(如移碼)。抑制基因tRNA的抑制活性可以表示為與第二抑制基因tRNA或與對照系統如缺乏O-RS的對照系統相比所觀察到的翻譯讀通活性的百分數。本發明提供了定量測定抑制活性的各種方法。特定Ο-tRNA和ORS對感興趣的選擇者密碼子(如琥珀密碼子)的抑制百分率指，與陽性對照構建物相比，位于編碼某表達檢測標記的核酸中的該給定表達檢測標記(如LacZ)，包括選擇者密碼子，在感興趣翻譯系統內的活性百分數，其中的感興趣的翻譯系統含有O-RS和Ο-tRNA，而陽性對照不含0-tRNA、O-RS和選擇者密碼子。因此，如果某缺乏選擇者密碼子的活性陽性對照標記構建物在一個給定翻譯系統內的活性是X，那么含有選擇者密碼子的被檢測構建物的抑制百分率為被檢測構建物在與陽性對照標記基本相同的表達環境條件下所顯示的X的百分比，其中該被檢測標記構建物所表達的翻譯系統也含有ο-tRNA和ο-RS。一般來說，表達被檢測標記的翻譯系統還包含能被O-RS和Ο-tRNA識別的氨基酸。任選地，抑制百分率的測定可以通過將該被檢測標記與“背景”或“陰性”對照標記構建物比較而精細確定，后者含有與被檢測標記相同的選擇者密碼子，但是該系統中不包含0-tRNA、O-RS和/或能被Ο-tRNA和/或O-RS識別的相關氨基酸。這種陰性對照可用于對該標記在感興趣翻譯系統中所產生的背景信號進行處理使抑制百分率測定標準化。抑制效率可通過本領域熟知的多種方法測定。例如，可利用β半乳糖苷酶報告分子試驗，如將衍生的IacZ質粒(該構建物在IacZ核酸序列中含有選擇者密碼子)和含有本發明的Ο-tRNA的質粒一起導入到合適生物(如可利用此正交組分的生物)的細胞內。也可導入相關合成酶(或者以多肽或編碼相關合成酶的多核苷酸形式)。將這些細胞在培養基內培養到所需的密度，如0D_達到約O.5時，采用BetaFluorβ-半乳糖苷酶檢測試劑盒(Novagen)進行β半乳糖苷酶試驗。抑制百分率可以計算為樣品相對于可比較對照，如衍生的IacZ構建物所顯示的活性的百分比，其中所述構建物在所需位置上含有相應的有義密碼子而不是選擇者密碼子。翻譯系統:術語“翻譯系統”指可以將氨基酸摻入到正在延伸的多肽鏈(蛋白)中的各組分。翻譯系統的各組分包括核糖體、tRNA、合成酶、mRNA等。本發明的Ο-tRNA和/或O-RS也可以加入到體外或體內的翻譯系統中，或者作為翻譯系統的一部分，如非真核細胞如細菌(如大腸桿菌)或真核細胞如酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、昆蟲細胞等的翻譯系統。非天然氨基酸:本文所用術語“非天然氨基酸”指20個常見天然氨基酸或硒代半胱氨酸或吡咯賴氨酸之外的任何氨基酸、修飾的氨基酸和/或氨基酸類似物，如圖I提供的17種非天然氨基酸。衍生自本文所用術語“衍生自”指從特定分子或生物、或者根據該特定分子或生物的信息分離的組分，或者利用該特定分子或生物的信息制備的組分。例如，衍生自第二多肽的多肽可包含與第二多肽的氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列。對多肽而言，可通過例如天然發生的誘變、人工定點誘變或人工隨機誘變獲得衍生的種類。用來衍生多肽的誘變可以是故意定點的或是故意隨機的，或是這兩者的混合。誘變多肽以形成衍生自第一多肽的不同多肽可以是隨機事件(例如，由聚合酶失真(infidelity)造成)，而衍生的多肽的鑒定可通過例如這里所述的合適的篩選方法完成。多肽的誘變通常需要操作編碼多肽的多核苷酸。陽件詵擇或篩詵標記:本文所用的術語“陽性選擇或篩選標記”指可通過其存在(例如表達、活化等)來鑒定含有該性狀的細胞的標記，例如具有該陽性選擇標記的細胞與不具有此性狀的細胞相比較。陰性選擇或篩選標記:本文所用的術語“陰性選擇或篩選標記”指可通過其存在(如表達、活化等)來鑒定不含有所選特性或性狀的細胞(如，與具有該特性或性狀的細胞相比較)。報告分子:本文所用的術語“報告分子”是指可用于鑒定和/或篩選感興趣系統內靶組分的組分。例如，報告分子可以包括蛋白質，如能賦予抗生素抗性或敏感性的酶(如β-內酰胺酶、氯霉素乙酰轉移酶(CAT)等)、熒光選擇標記(如綠色熒光蛋白(如GFP)、YFP、EGFP,RFP等)、發光標記(如螢火蟲熒光素酶蛋白)、親和力篩選標記，或者陽性或陰性選擇標記基因如lacZ、β-gal/lacZ(β-半乳糖苷酶)、Adh(乙醇脫氫酶)、his3、ura3、leu2、lys2等。真核生物本文所用的術語“真核生物”指屬于真核生物界的生物。真核生物與原核生物的區別總體上在于它們通常是多細胞生物(但不排除單細胞生物，如酵母)，存在膜包裹的核及其它膜包裹的細胞器，線形遺傳物質(即線形染色體)，無操縱子，存在內含子、加帽信使(messagecapping)和poly_AmRNA,以及其它生化特征,如可鑒別的核糖體結構。真核生物包括，例如，動物(如哺乳動物、昆蟲、爬行動物、鳥類等)、纖毛蟲、植物(如單子葉植物、雙子葉植物、藻類等)、真菌、酵母、鞭毛蟲、微孢子蟲、原生生物等。原核生物本文所用的術語“原核生物”指屬于單蟲無核原生動物(也稱為Procarya)界的生物。原核生物與真核生物的區別通常在于，它們是單細胞生物，通過出芽或分裂進行無性生殖，缺乏膜包裹的核或其它膜包裹的細胞器，環形染色體，存在操縱子，無內含子、加帽信使和PoIy_AmRNA,以及其它生化特征,如可鑒別的核糖體結構。Prokarya包括真細菌和古菌(有時也稱為“古細菌”)亞界。藍細菌(藍綠藻)和支原體有時是單蟲無核原生動物界下的單獨類型。迦童:本文所用的術語“細菌”和“真細菌”指不同于古直的原核生物。類似地，古菌指不同于真細菌的原核生物。可通過許多形態學標準和生化標準區分真細菌和古菌。例如，以下差異可用來將生物歸為真細菌或古菌核糖體RNA序列、RNA聚合酶結構、存在或不存在內含子、抗生素敏感性、存在或不存在細胞壁肽聚糖和其它細胞壁組分、膜脂為分支或不分支的結構、以及存在/不存在組蛋白和組蛋白樣蛋白質真細菌的例子包括大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)、嗜熱棲熱菌(Thermusthermophilus)和嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillusstearothermophilus)。古菌的例子包括詹氏甲燒球菌(Methanococcusjannaschii)(Mj)、馬氏微球菌(Methanosarcinamazei)(Mm)、熱自養甲燒球菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)(Mt)、海沼甲燒球菌(Methanococcusmaripaludis)、坎氏甲燒嗜熱菌(Methanopyruskandleri)、鹽桿菌屬如沃氏鹽桿菌(Haloferaxvolcanii)和嗜鹽菌NRC-1(HalobacteriumspeciesNRC-1)、閃爍古生球菌(Archaeoglobusfulgidus)(Af)、激烈火球菌(Pyrococcusfurious)(Pf)、超嗜熱古菌(Ph)、超耐高溫熱棒菌(Pyrobaculumaerophilum)、火球菌(Pyrococcusabyssi)、硫橫礦硫化葉菌(Sulfolobussolfataricus)(Ss)、硫化葉菌(Sulfolobustokodaii)、Aeuropyrumpernix(Ap)、卩遼酸熱原體(Thermoplasmaacidophilum)和火山熱原體(Thermoplasmavolcanium)。保守變體:本文所用術語“保守變體”就翻譯組分而言指一種翻譯組分，如保守變體Ο-tRNA或保守變體0-RS，其功能與基礎組分Ο-tRNA或O-RS相似，但在序列上與參照Ο-tRNA或O-RS相比有所不同。例如，O-RS或保守變體O-RS可用非天然氨基酸如含有N-乙酰半乳糖胺部分的氨基酸氨酰化同源Ο-tRNA。在該例子中，所述O-RS及保守變體O-RS不具有相同的氨基酸序列。所述保守變體可具有，例如，一個、兩個、三個、四個、五個或更多變異，只要保守變體與相應的Ο-tRNA或O-RS互補。一些實施方案中，保守變體O-RS相比衍生出它的O-RS含有一個或多個保守性氨基酸取代。一些實施方案中，保守變體O-RS相比衍生出它的O-RS含有一個或多個保守性氨基酸取代，此外還保留了O-RS的生物學活性；例如，保守變體O-RS保留了衍生出它的親本O-RS分子至少10%，或者至少20%，至少30%，或至少40%的生物學活性。在一些優選的實施方案中，所述保守變體O-RS保留了衍生出它的親本O-RS分子至少50%的生物學活性。保守變體O-RS的保守性氨基酸取代可出現在該O-RS的任何結構域內，包括氨基酸結合口袋。選擇或篩選試劑:本文所用的術語“選擇或篩選試劑”指可利用其存在從一群組分中選擇或篩選某些特定組分的試劑。例如，選擇或篩選試劑可包括但不限于營養素、抗生素、光的波長、抗體、表達的多核苷酸等。選擇試劑可以使用不同的濃度、強度等。跑應:本文所用的術語“響應”指本發明的tRNA識別選擇者密碼子并介導將結合于tRNA的非天然氨基酸摻入正在生長的多肽鏈的過程。本文所用的術語“編碼”指利用多聚大分子或序列符號串上的信息指導產生第二分子或序列符號串的過程，所述第二分子或序列符號串與第一分子或序列符號串不同。如本文所述，該術語的使用范圍很寬，可用于許多方面。一方面，術語“編碼”描述DNA的半保守性復制過程，其中雙鏈DNA分子的一條鏈作為DNA依賴的DNA聚合酶的模板編碼出新合成的一條互補姊妹鏈。另一方面，術語“編碼”指利用一個分子中的信息指導產生化學性質與第一分子不同的第二分子的過程。例如，DNA分子可編碼RNA分子(如通過DNA依賴的RNA聚合酶參與的轉錄過程)。另外，RNA分子也可以編碼多肽，例如在翻譯過程中。當該術語用于描述翻譯過程時，該術語也可以擴展到編碼氨基酸的三聯密碼子。在某些方面，RNA分子也可編碼DNA分子，例如通過RNA依賴的DNA聚合酶參與的反轉錄過程。在另一個方面，DNA分子可編碼多肽，應當理解的是，在這種情況下，術語“編碼”是指轉錄和翻譯兩個過程。發明詳述本發明提供了受20種天然氨基酸限制的翻譯系統固有局限性的解決方案。所述解決方案包括利用正交翻譯系統將具有新型特性的非天然氨基酸程序性定點生物合成摻入到蛋白質中。我們在本文中描述了新的組合物(例如新的氨酰-tRNA合成酶)和新的方法，以便響應選擇者密碼子(例如，琥珀無義密碼子、TAG)將各種非天然氨基酸高效率特異性地通過基因摻入到蛋白質中。一些情況下，非天然氨基酸側鏈可被特異性地并區域選擇性地修飾。由于這些非天然氨基酸取代基的獨特反應化學，可高度選擇性地修飾要摻入它們的蛋白質。一些情況下，非天然氨基酸反應基的優點在于，它們對于體內系統是完全外來的，從而提高了反應選擇性。一些方面，可用允許進行體外和體內蛋白質偶聯反應并保留蛋白質生物學活性的相對溫和的反應條件進行修飾反應。對與蛋白質中非天然氨基酸偶聯的物質的特性沒有特別限制，且可以是任何所需實體(entity)，例如，染料、熒光團、交聯劑、糖類衍生物、聚合物(例如，聚乙二醇衍生物)、光交聯劑(photocrosslinker)、細胞毒化合物、親和標記、生物素衍生物、樹脂、珠、第二蛋白或多肽(或其它)、多核苷酸(例如，DNA、RNA等)、金屬螯合齊U、輔因子、脂肪酸、碳水化合物等。其它方面，摻入的非天然氨基酸賦予摻入了它們的蛋白質新的生物特性。例如，非天然氨基酸可以是熒光氨基酸、光囚禁的(photocaged)或光可活化的(photoactivatable)氨基酸、可作為供體或受體參與FRET對的氨基酸、氧化還原活性氨基酸、金屬螯合氨基酸等。一些方面，為證明(而非限制)本發明，這里公開的內容證實，非天然氨基酸部分可被摻入模型蛋白質。這并不是說所述非天然氨基酸只能被摻入這種模型蛋白質。從這里的公開內容顯見，非天然氨基酸可摻入任何感興趣的給定蛋白質，這對于用于治療和研究目的的蛋白質而言是有利的。我們開發了可在真細菌和酵母中發揮作用的新的正交tRNA/氨酰-tRNA合成酶對，它們可響應選擇者密碼子位點特異性摻入非天然氨基酸(例如，圖I提供的非天然氨基酸)。簡言之，我們已經鑒定了分別在大腸桿菌宿主細胞或酵母宿主細胞中用非天然氨基酸選擇性加載抑制基因tRNA的詹氏甲燒球菌(Methanococcusjanaschii)酪氨酰-tRNA合成酶和大腸埃希氏菌亮氨酰-tRNA合成酶的新的突變體。所涉及的這些tRNA-合成酶對可用來在蛋白質中位點特異性摻入各種非天然氨基酸。在蛋白質中摻入非天然氨基酸可以是程序性地，以便通過工程構造編碼感興趣蛋白質的多核苷酸而在任何所述位置進行摻入，所述多核苷酸含有作為摻入非天然氨基酸信號的選擇者密碼子。ιΗ交tRNA/氨釀-tRNA合成酶技術理解與正交tRNA和正交氨酰-tRNA合成酶對有關的活性有助于理解本發明的新的組合物和方法。有關正交tRNA和氨酰-tRNA合成酶技術的討論可見，例如，國際公開WO2002/085923、TO2002/086075,WO204/09459、TO2005/019415、TO2005/007870和WO2005/007624。也可參見Wang和Schultz的“遺傳密碼的擴展”(ExpandingtheGeneticCode),AngewandteChemieInt.Ed.,44(I):34-66(2005),其內容通過引用全文納入本文。為在遺傳密碼中加入額外的反應性非天然氨基酸，需要含有氨酰-tRNA合成酶和適當tRNA的新的正交對，它們可在宿主翻譯機制中有效發揮作用，但是否與翻譯系統“正交”仍在討論中，這意味著它可不依賴于翻譯系統的內源性合成酶和tRNA發揮作用。正交對的所需特性包括，僅編碼或識別特定密碼子如選擇者密碼子的tRNA不由任何內源性tRNA編碼，且氨酰-tRNA合成酶僅用一種特定的非天然氨基酸優先氨酰化(或“加載”)其同源tRNA。所述0-tRNA通常也不被內源性合成酶氨酰化。例如，在大腸桿菌中，正交對將包括不與任何內源性tRNA(例如，大腸桿菌中有40種)交叉反應的氨酰-tRNA合成酶和不被任何內源性合成酶(例如，大腸桿菌中有21種)氨酰化的正交tRNA。這里描述的本發明提供了在真細菌如大腸桿菌或者酵母中進行遺傳編碼并將非天然氨基酸摻入蛋白質的正交對，其中所述正交組分不與宿主細胞翻譯機制的內源性大腸桿菌或酵母組分交叉反應，但識別所需非天然氨基酸并響應選擇者密碼子(例如，琥珀無義密碼子、TAG)將其插入蛋白質。本發明提供的正交組分包括衍生自詹氏甲烷球菌酪氨酰tRNA-合成酶的正交氨酰-tRNA合成酶和突變體酪氨酰tRNAeuA琥珀抑制基因，它們在真細菌宿主細胞中作為正交對。本發明還提供了衍生自大腸桿菌亮氨酰-tRNA-合成酶的正交組分和突變體大腸桿菌亮氨酰tRNAeuA琥珀抑制基因，它們在酵母宿主細胞中作為正交對。在這些系統中，所述突變體氨酰-tRNA合成酶用其各自的非天然氨基酸而不用常見的20種氨基酸中的任何一種氨酰化所述抑制基因tRNA。本發明提供了鑒定和產生其它正交tRNA-氨酰-tRNA合成酶對，例如可用來將非天然氨基酸摻入蛋白質的0-tRNA/0-RS對的組合物和方法。本發明的0-tRNA/0-RS對能夠介導將非天然氨基酸如圖I所示的非天然氨基酸摻入由多核苷酸編碼的蛋白質，其中所述多核苷酸含有例如在體外被Ο-tRNA識別的選擇者密碼子。所述Ο-tRNA的反密碼子環識別mRNA上的選擇者密碼子并將其氨基酸(如圖I所示的非天然氨基酸)摻入多肽的該位點上。通常，本發明的正交氨酰-tRNA合成酶僅用一種特定的非天然氨基酸優先氨酰化(或加載)其0-tRNA。將非天然氨基酸(例如，圖I中提供的非天然氨基酸)位點特異性摻入蛋白質的能力有利于蛋白質的研究以及能夠工程構建具有新特性的蛋白質。例如，含有一種或多種非天然氨基酸的蛋白質的表達有助于通過特定的標記研究蛋白質，改變酶的催化功能，改變生物學活性或降低與基底的交叉反應性，將一種蛋白質與其它蛋白質、小分子或生物分子交聯，降低或消除蛋白質降解，提高蛋白質的體內半衰期(例如，將引入的反應位點PEG化或進行其它修飾)等。IH交tRNA/ιΗ交氨酰-tRNA合成酶及它們組成的對適合產生含有一種或多種非天然氨基酸的蛋白質的翻譯系統通常描述于以下國際發明者P·舒爾茨,L·阿方達,J·R·齊圖魯如,A·戴特斯,D·格羅夫,D·薩默爾,曹蘿麟,王江云,武寧,謝建明,曾華強申請人:斯克利普斯研究院