一種海參抗氧化多肽的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種海參抗氧化多肽及其制備方法，該方法以海參肉或海參內臟蛋白為原料，通過對酸性蛋白酶的酶解，分離純化得到特異性海參抗氧化多肽，其氨基酸全序列為：kvlltflvv。本發明所制得的海參抗氧化多肽彌補了天然抗氧化劑所具有的缺陷，并且消除了公眾對人工合成抗氧化劑的憂慮，為開發基于食品源的抗氧化多肽以及探索其在食品、醫學上的廣泛應用奠定了基礎。
【專利說明】一種海參抗氧化多肽

【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物【技術領域】，提供了一種海參抗氧化多肽。

【背景技術】
[0002] 生物分子的氧化是一個自由基介導的過程，它會對食品和生物系統造成許多不利 的影響。在好氧器官內，與動脈硬化、癌癥等多種疾病相關的游離自由基會不可避免地隨著 氧代謝的過程而產生。在食品中，營養成分的氧化會產生過氧化物，其不僅會影響食品的營 養價值，造成食品品質下降，嚴重的甚至還會導致攝入者的身體發生疾病。因此，尋找安全 的抗氧化劑以抑制過氧化物產生一直是生化營養學的研究熱點。由于BHT、TBHQ等化學合 成抗氧化劑比天然抗氧化劑具有更好的效果和更便宜的價格，因此其已經被廣泛應用于食 品行業中。但是，目前有研究發現合成抗氧化劑對人體肝、脾、肺等器官具有蓄積性致癌作 用，從而引起了人們對其安全性的擔憂，并且開始逐漸限制其在食品中的使用。于是人們把 目光轉向天然抗氧化劑。a -生育酚是一種被普遍使用的天然抗氧化劑，它能有效保持食品 中油脂的穩定性，但是卻不利于食品保存。因此，我們有必要尋找一種其它來源的安全的天 然抗氧化劑。
[0003] 多肽是分子結構介于氨基酸和蛋白質之間的一類化合物，使蛋白質具有一定的生 理功能。在人類的生命活動中，肽在體內的消化吸收優于游離的氨基酸，且有著區別于氨基 酸的體內輸送體系。某些短肽在提供人體生長、發育所必需的營養物質的同時，還能夠防病 治病，調節人體機能，這些具有生物活性的多肽被稱為生物活性肽。研究發現，很多不同來 源的多肽都具有抗氧化能力，如水解酪蛋白、大豆蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、油料種子 蛋白、小麥醇溶蛋白和玉米蛋白等得到的多肽都具有一定的抗氧化性。
[0004] 國內海參加工目前大多停留在初級加工階段，由于資源利用率低，加工過程產生 的下腳料浪費等原因造成資源浪費，甚至是環境污染。海參肉或海參內臟中含有大量蛋 白質，且其組成均衡，利用現代生物技術對其中的蛋白質資源進行深加工，合理的選用酶類 等，通過工藝優化將使得抗氧化活性肽的研究具有更廣闊的前景。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的在于針對天然抗氧化劑的不足、以及人工合成抗氧化劑的安全性堪 憂，提供一種海參抗氧化多肽及其制備方法。本發明制得的海參抗氧化多肽抗氧化活性高， 彌補了天然抗氧化劑的缺陷，消除了人們對人工合成抗氧化劑安全性的擔憂。
[0006] 為了實現發明目的，本發明采用如下技術方案： 一種海參抗氧化多肽，其氨基酸序列為：kvlltflvv。
[0007] -種制備如上所述的海參抗氧化多肽的方法：以海參肉或海參內臟為原料提取蛋 白，然后對其進行酶解；酶解產物經濃縮除雜得海參多肽溶液，海參多肽溶液再經分離純 化、冷凍干燥得到海參抗氧化多肽。
[0008] 所述酶解條件為：pH為3. 5、溫度50°C、酶解時間為6 h、酶-底物配比為3000U/ g;所述酶為酸性蛋白酶。
[0009] 所述分離純化的方法包括超濾、SP-Sephadex C-25離子交換色譜、Sephadex G-50 分子篩和RP-HPLC反相高效液相色譜。
[0010] 所述分離純化的具體步驟為： (1) 首先利用膜過濾系統對海參多肽溶液進行超濾分離，得到不同分子量的多肽組 分； (2) 收集具有最佳抗氧化活性的組分，用SP-Sephadex C-25陽離子交換色譜進行分離， 上樣后洗去未吸附組分，再以乙酸-乙酸鈉緩沖液進行線性梯度洗脫，流速為0. 5ml/min， 在215nm下進行測量，測定各吸收峰對應的洗脫組分的抗氧化活性； (3) 收集具有最佳抗氧化活性的組分，用S印hadex G-50凝膠色譜進行分離，洗脫液為 去離子水，流速為0. 5ml/min，在215nm下進行測量，測定各吸收峰對應的洗脫組分的抗氧 化活性； (4) 收集具有最佳抗氧化活性的組分，利用RP-HPLC反相高效液相色譜進行進一步的 分離，采用乙腈和水的混合液進行梯度洗脫，收集體積比為46 %乙腈和54 %水處的洗脫 峰，得到海參抗氧化多肽； (5) 利用蛋白質固相序列分析儀鑒定多肽的氨基酸序列。
[0011] 步驟（1)中所述的多肽組分包括分子量彡3000 Da，1500-3000 Da，彡1500 Da的 組分。
[0012] 步驟（2)中所述的乙酸-乙酸鈉緩沖液濃度為0. 02mol/L、pH4. 5,含0?0. 35mol/ L NaCl。
[0013] 步驟（4)中分離時所用色譜柱為Gemini 5 ii C18,上樣量為IOOii L，流速為Iml/ min，檢測波長為215nm。
[0014] 步驟（4)中梯度洗脫為：洗脫液自含體積比為10%乙腈和90%水的混合液開始，至 體積比為90%乙腈和10%水的混合液結束。
[0015] 本發明立足于尋找一種天然高效的抗氧化劑，以海參蛋白為出發點，通過酸性蛋 白酶的切割條件控制，切割為具有特定的肽鏈長度和結構域組成的活性多肽，而使抗氧化 活性得以高效實現。
[0016] 本發明改變了現有抗氧化劑的提取與運用的思路和方法，消除了人工合成抗氧化 劑所可能引起的副作用，所提取得到的海參抗氧化多肽是天然抗氧化劑，可以取代傳統的 合成抗氧化劑；并且本發明還改善了我國對海參蛋白利用率偏低的情況，既可解決大量海 參資源的高效利用問題，又能解除消費者對抗氧化劑在食品安全方面的顧慮，對科技、經濟 和食品工業的發展具有深遠意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1為海參抗氧化多肽的RP-HPLC圖譜，C峰為海參抗氧化多肽的色譜峰； 圖2為純化的海參抗氧化多肽清除DPPH自由基的"量-效"關系曲線。
[0018] 圖3為純化的海參抗氧化多肽清除ABTS自由基的"量-效"關系曲線。
[0019] 圖4為純化的海參抗氧化多肽抑制Fe2+誘導卵黃脂蛋白多不飽和脂肪酸過氧化反 應的"量-效"關系曲線。

【具體實施方式】
[0020] 海參抗氧化多肽的制備方法，具體步驟如下： (1) 海參蛋白的提取 海參蛋白質提取工藝條件為： 將海參或海參內臟清洗3-5次，浸提pH為7.0,提取溫度為40-80 °C，料液比為 1:4-1:8 (重量比)，提取時間為2-6 h，離心IOOOOg 20分鐘，收集上清液，經過濾、濃縮和冷 凍干燥后得到海參蛋白。 (2) 海參蛋白的酶解 酶購自上海生物試劑公司（中國?上海)。
[0021] 采用酸性蛋白酶酶解海參蛋白，蛋白濃度為30mg/ml，酶解條件取pH為3. 5、溫度 50°C、酶解時間為6h、酶與底物比為（3000U/g)，用2M HCl調節pH穩定，水解6h后，沸水浴 中滅酶15min，然后迅速冷卻至室溫，置于離心機中，以4000r/min離心15min，取上清液備 用。
[0022] (3 )酶解產物的濃縮、除雜 利用納濾系統對蛋白酶解液進行濃縮后，加入4倍體積乙醇沉降大分子蛋白質， 12000r/min離心20min得上清液即為海參多肽溶液。
[0023] (4)酶解產物的分離 利用膜過濾系統對海參多肽溶液進行超濾分離，利用分子量截留范圍不同的超濾膜對 酶解產物進行分離，得到不同分子量的多肽，包括彡3000 Da，1500-3000 Da，彡1500 Da等 組分。
[0024] (5)酶解產物的純化 將得到的酶解產物分為3個分子量范圍不同的組分，分別為分子量大于3000Da的組 分、分子量介于1500Da和3000Da的組分、分子量小于1500Da的組分；收集具有最佳抗氧化 活性的組分，再經過SP-Sephadex C-25陽離子交換色譜(長20cm，直徑I. 6cm)進行分離， 以含0?0? 35mol/L NaCl的0? 02mol/L、pH4. 5乙酸-乙酸鈉緩沖液進行線性梯度洗脫， 流速為〇. 5ml/min ;收集具有最佳抗氧化活性的組分，再用Sephadex G-50 (長100cm，直徑 2. 6cm)凝膠色譜進行分離，洗脫液為去離子水，流速為0. 5ml/min，洗脫峰在215nm下進行 測量；收集具有最佳抗氧化活性洗脫峰對應的組分，利用RP-HPLC反相高效液相色譜進行 再進一步的分離，所用色譜柱為Gemini C18,上樣量為IOOiiL,流速為lml/min，檢測 波長為215nm。洗脫液自含10%乙腈和90%水（v/v)的混合液開始，至90%乙腈和10%水 (v/v)的混合液結束，進行梯度洗脫，收集46 %乙腈和54 %水（v/v)處的洗脫峰對應的組 分，得到本發明的高純度的海參抗氧化多肽。
[0025] (6)抗氧化多肽的氨基酸序列測定 利用蛋白質固相序列分析儀（Applied Biosystems Model 476A, Perkin Elmer Co-MA， U.S.A) 測定本發明的抗氧化多肽的氨基酸全序列為 kvlltflvv。
[0026] ( 7 )抗氧化活性的測試 i DPPH自由基清除能力的測定 利用DPPH (l，l-Diphenyl-2-picryl_hydrazyl)自由基清除率測定法研究抗氧化多 肽。配制濃度為I X 10_5m〇l/L的DPPH乙醇溶液，避光保存。將2mL，0. ImM的DPPH無水 乙醇溶液加入到含有2mL不同酶解樣品的潔凈試管中，混勻。室溫下放置30min后，于517 nm處測定吸光度，吸光值越小，表明自由基清除能力越強。 情除率(。。>=[I-(ArAj)A:,) X 100。0
[0027] 式中，Atl為2 mL，0. ImM的DPPH無水乙醇溶液+2mL的樣品溶劑，空白對照；Ai為 2mL，0. ImM的DPPH無水乙醇溶液+2mL的樣品；Aj為2mL的無水乙醇+2 mL的樣品。
[0028] ii ABTS自由基清除活性的測定 以去離子水將ABTS溶解，使ABTS濃度達到7mmol/L，加入過硫酸鉀，使過硫酸鉀的濃 度為2. 45 mmol/L。之后將該溶液在室溫下置于暗處過夜12?16h。將生成的ABTS自由 基溶液用磷酸緩沖液（？83,0.2 111〇1/1，？117.4)稀釋，使其在73411111下的吸光值為0.70。取 0. Iml酶解液與2. 9ml ABTS自由基液混合，搖勻30s，暗處反應10 min，然后在734nm下測 定反應液的吸光值。以蒸餾水代替水解液作空白。 精除率。)=(A:,- A:) A:, X 1 〇〇。0
[0029] 式中，Atl為2. 9 mL ABTS試劑與0. I mL蒸餾水混合液的吸光值；Aj為2. 9 mL ABTS 試劑與0. I mL酶解液混合液的吸光值。
[0030] iii抗脂質體過氧化活性的測定 用等體積新鮮的雞蛋卵黃和磷酸緩沖液（pH7.4,0. lmol/L)混合，使用前稀釋25 倍并用磁力攪拌機攪拌均勻。在試管中分別加入2.4ml卵黃稀釋液、2.4ml 25mmol/L FeSO4 ? H20、200 ii L水解液樣品，混勻后在37°C下水浴4h，加入0. 8ml 50%三氯乙酸和2ml TBA，混勻后在95°C恒溫30min。冷卻至室溫后，8000r/min離心20min，取上清液于532nm 下測定吸光值。以蒸餾水代替水解液作為空白。 抑制率(D a)= ((A:,- A〇A:i〕X 1 〇〇°。
[0031] 式中，Aci為空自對照組的吸光度▲為樣品組的吸光度。
[0032] 為了進一步了解本
【發明內容】
、特點及功效，茲例舉以下實施例，但本發明不限于以 下實施例。
[0033] 實施例1 稱取5.0克海參蛋白用去離子水溶解并定容至250ml，然后用2mol/L HCl將其pH調 節至3. 0。先將該溶液水浴加熱到50°C，接著再按照酶-底物配比為3000U/g的比例加入 相應量的酶，酶解時間為6小時。接著在沸水浴中滅酶15分鐘，冷卻后再4000rpm離心15 分鐘。收集上清液備用。
[0034] 將上清液利用膜過濾系統對海參多肽溶液進行超濾分離，利用分子量截留范圍不 同的超濾膜對酶解產物進行分離，得到彡3000 Da，1500-3000 Da，彡1500 Da的不同組分， 測定其抗氧化活性。測定結果為：分子量小于1500Da的組分具有最好的抗氧化活性。
[0035] 收集分子量小于1500Da的組分，用SP-S印hadex C-25陽離子交換色譜(長20cm， 直徑I. 6cm)進行再進一步的分離，以含0. 25mol/L NaCl的0. 02mol/L、pH4. 5乙酸-乙酸 鈉緩沖液進行線性梯度洗脫，流速為〇. 5ml/min，洗脫峰在215nm下進行測量，收集各峰對 應的組分并測定抗氧化活性。
[0036] 將分離出來的抗氧化活性最明顯的組分峰用S印adex G-50凝膠過濾色譜(長 20cm，直徑I. 6cm)再進行分離，洗脫液為去離子水，流速為0. 5ml/min，洗脫峰在215nm下進 行測量。收集各峰并測定抗氧化活性。
[0037] 將分離出來的最好的抗氧化活性組分利用RP-HPLC反相高效液相色譜進行再進 一步的分離，所用色譜柱為Gemini C18,上樣量為IOOiiL,流速為lml/min，檢測波長 為215nm。洗脫液自含10%乙腈和90%水（v/v)的混合液開始，至90%乙腈和10%水（v/v) 的混合液結束，進行梯度洗脫，收集46 %乙腈和54 %水（v/v)處的洗脫峰，得到本發明的 高純度的特異性抗氧化多肽，如圖1所示。C峰為該抗氧化多肽的色譜峰，得到高純度的海 參抗氧化多肽。
[0038] 純化后的海參抗氧化多肽具有很強的抗氧化能力，由圖2、圖3和圖4可以看出，它 具有較強的清除DPPH自由基、ABTS自由基以及抑制脂質過氧化反應的能力。
[0039] 利用蛋白質固相測序儀（Applied Biosystems Model 476A, Perkin Elmer Co-MA， U.S.A) 測定純化后的抗氧化多肽的氨基酸序列。得到其氨基酸全序列為：kvlltflw。
[0040] 以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與 修飾，皆應屬本發明的涵蓋范圍。
【權利要求】
1. 一種海參抗氧化多肽，其特征在于：所述海參抗氧化多肽的氨基酸序列為： kvlltflvv〇
2. -種制備如權利要求1所述的海參抗氧化多肽的方法，其特征在于：以海參肉或海 參內臟為原料提取蛋白，然后對其進行酶解；酶解產物經濃縮除雜得海參多肽溶液，海參多 肽溶液再經分離純化、冷凍干燥得到海參抗氧化多肽。
3. 根據權利要求2所述的海參抗氧化多肽的制備方法，其特征在于：所述酶解條件為： pH為3. 5、溫度50°C、酶解時間為6 h、酶-底物配比為3000U/g ;所述酶為酸性蛋白酶。
4. 根據權利要求2所述的海參抗氧化多肽的制備方法，其特征在于：所述分離純化的 方法包括超濾、SP-Sephadex C-25離子交換色譜、Sephadex G-50分子篩和RP-HPLC反相高 效液相色譜。
5. 根據權利要求2所述的海參抗氧化多肽的制備方法，其特征在于：所述分離純化的 具體步驟為： (1)首先利用膜過濾系統對海參多肽溶液進行超濾分離，得到不同分子量的多肽組 分； (2 )收集具有最佳抗氧化活性的組分，用SP-Sephadex C-25陽離子交換色譜進行分離， 上樣后洗去未吸附組分，再以乙酸-乙酸鈉緩沖液進行線性梯度洗脫，流速為0. 5ml/min， 在215nm下進行測量，測定各吸收峰對應的洗脫組分的抗氧化活性； (3) 收集具有最佳抗氧化活性的組分，用S印hadex G-50凝膠色譜進行分離，洗脫液為 去離子水，流速為0. 5ml/min，在215nm下進行測量，測定各吸收峰對應的洗脫組分的抗氧 化活性； (4) 收集具有最佳抗氧化活性的組分，利用RP-HPLC反相高效液相色譜進行進一步的 分離，采用乙腈和水的混合液進行梯度洗脫，收集體積比為46 %乙腈和54 %水處的洗脫 峰，得到海參抗氧化多肽； (5) 利用蛋白質固相序列分析儀鑒定多肽的氨基酸序列。
6. 根據權利要求5所述的海參抗氧化多肽的制備方法，其特征在于：步驟（1)中所述的 多肽組分包括分子量彡3000 Da，1500-3000 Da，彡1500 Da的組分。
7. 根據權利要求5所述的海參抗氧化多肽的制備方法，其特征在于：步驟（2)中所述的 乙酸-乙酸鈉緩沖液濃度為0. 02mol/L、pH4. 5,含0?0. 35mol/L NaCl。
8. 根據權利要求5所述的海參抗氧化多肽的制備方法，其特征在于：步驟（4)中分離時 所用色譜柱為Gemini 5 ii C18,上樣量為100 ii L，流速為lml/min，檢測波長為215nm。
9. 根據權利要求5所述的海參抗氧化多肽的制備方法，其特征在于：步驟（4)中梯度 洗脫為：洗脫液自含體積比為10%乙腈和90%水的混合液開始，至體積比為90%乙腈和10% 水的混合液結束。
【文檔編號】C07K1/20GK104356201SQ201410614617
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月5日 優先權日:2014年11月5日
【發明者】汪少蕓, 李靈, 趙立娜, 邵彪 申請人:福州大學