一種增強乳酸菌膽汁耐受能力的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種增強乳酸菌膽汁耐受能力的方法，屬于基因工程技術領域。
【背景技術】
[0002] 乳酸菌（LAB)作為益生菌，在工業、農業和醫學等領域與人類生活密切相關，是一 類在食品中應用最廣泛的重要的工業菌株，能夠作為活的載體在食品或體內傳遞感興趣的 蛋白。其中，LAB的模式菌株Lactococcus lactis及常用的nisin控制的食品級誘導表達 系統 NICE(nisin controlled gene expression system)為 LAB 在食品、醫藥工程及其改 良方面的應用提供了可能。
[0003] 然而，乳酸菌為了有效發揮益生功能，必須耐受來自宿主胃腸道環境的各種生理 化學屏障以提高其腸道定植能力。其中，膽汁脅迫是乳酸菌面臨的重要挑戰之一。結合膽 鹽是膽汁酸與甘氨酸或牛磺酸結合并以鈉鹽或鉀鹽形式存在的一類重要的膽汁組分，其在 脂肪的乳化和增溶中發揮著必不可少的作用；同時，結合膽鹽的雙親性使其具有擾亂細胞 膜脂質雙分子層的特性，從而干擾細胞穩態而呈現出抗菌性。
[0004] 膽鹽水解酶（BSH)是由bsh基因編碼的一種胞內酶，廣泛存在于腸道微生物中，能 夠水解腸道內的結合態膽鹽形成氨基酸和游離膽汁酸。其功能體現在兩個方面：一、對人類 宿主的作用。由于經BSH作用后產生的游離膽汁酸會與腸道中的鈉鹽/鉀鹽形成去結合型 膽鹽，該去結合型膽鹽比水解前的結合態膽鹽重吸收效率降低，從而會隨糞便排出，而膽固 醇的主要去路是轉變成結合膽鹽，因此通過BSH的水解作用可以使膽固醇不斷向合成結合 膽鹽的方向進行以保證腸道內結合膽鹽與脂質物質的平衡，從而消耗體內更多的膽固醇， 達到降低血清膽固醇的目的。二、對微生物的作用。BSH是腸道微生物為了抵抗膽鹽得以生 存而產生的一種代謝產物；經BSH作用形成的氨基酸既可以作為營養物質被菌體利用，又 能夠解除結合膽鹽的毒害作用，提高益生菌的膽汁耐受能力及腸道定植能力。
[0005] 因此，運用基因工程手段獲得攜有BSH活性的乳酸菌菌株可以為研究BSH作用于 菌體自身和宿主提供技術平臺，也為應用口服活菌細胞療法控制人體血清膽固醇水平提供 了一種有效提高菌體細胞膽汁耐受和腸道定植能力的技術方法。

【發明內容】

[0006] 本發明提供了兩株膽汁耐受能力提高了的乳酸乳球菌，是將含有編碼膽鹽水解酶 的基因導入乳酸菌得到的兩株基因工程菌。
[0007] 所述膽鹽水解酶基因為bshl和bsh2 ;bshl基因序列如SEQ ID NO. 1所示；bsh2 基因序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0008] 所述乳酸菌為乳酸乳球菌。
[0009] 所述膽鹽水解酶優選bshl。
[0010] 本發明所要解決的另一個技術問題是提供一種增強乳酸乳球菌膽汁耐受能力的 方法，包括如下步驟：
[0011] 1)設計引物以LMG14476的基因組DNA為模板擴增出bshl和bsh2基因；
[0012] 2)將bshl和bsh2基因分別連接到乳酸乳球菌表達載體pNZ8148,得到重組載體； pNZ8148-bshl和 pNZ8148-bsh2
[0013] 3)重組載體轉化至 Lactococcus lactis NZ9000。
[0014] 所述引物根據NCBI網站報道的Lactobacillus salivarius LMG14476中膽鹽水 解酶BSH1和BSH2的基因序列設計，引物序列如下：
[0015] bshl-F(SEQ ID NO. 3)：
[0016] 5' -ATTATAAGGAGGCACTCACCATGTGTACAGCAATTACTTTAAATGGTA-3'
[0017] bshl-R(SEQ ID NO. 4)：
[0018] 5 ' -GAAAGCTTGAGCTCTCTAGATTAATTCAACTTATTTATTATTTGTTTTCTT-3 '
[0019] bsh2-F(SEQ ID NO. 5)：
[0020] 5' -ATTATAAGGAGGCACTCACCATGTGTACAGCAATTACTTTAAATGG-3'
[0021] bsh2-R(SEQ ID NO. 6)：
[0022] 5 ' -GAAAGCTTGAGCTCTCTAGATTAATTCAACTTATTTATTATTTGTTTTCTTT-3 '
[0023] 參照KOD-Plus-Neo試劑盒說明書配制PCR反應體系；PCR擴增條件為：95°C預變 性5!1^11 ;95°(：變性3〇8,45°(：退火6〇8,68°(：延伸11^11，5個循環；95°(：變性3〇8,55°(：退火 60s，68°C延伸 lmin，25 個循環；68°C延伸 10min。
[0024] 利用同源重組酶Exnase II將膠回收純化后的PCR產物連接到乳酸乳球菌表達 載體 pNZ8148,得到重組載體 pNZ8148_bshl 和 pNZ8148_bsh2,分別轉化至 Lactococcus lactis NZ9000,經篩選鑒定獲得重組菌 Lactococcus lactis NZ9000-pNZ8148_bshl 和 Lactococcus lactis NZ9000-pNZ8148_bsh2。
[0025] 膽鹽水解酶酶活測定方法：收集菌體，用0. 1M磷酸鹽緩沖液（pH 6. 0)洗滌離心2 次，調整菌濃在600nm下吸光度為5。取lmL上述細胞懸濁液，超聲破碎7min (工作時間：間 歇時間=2:4)，離心收集上清液。取10 μ L上清液用0. 1M磷酸鹽緩沖液（pH 6. 0)稀釋至 90 μ L，加入10 μ L結合膽鹽（200mM)混合，于37°C孵育30min，加入等體積的15% (w/v)三 氯乙酸終止反應，離心后取10 μ L上清液與190 μ L茚三酮試劑混合，于100°C反應15min， 冷卻后于570nm處測定吸光值，根據甘氨酸標準曲線進行計算。其中，茚三酮試劑的組成 為：0· 5mL 1 % (w/v)茚三酮（溶解于0· 5M、ρΗ5· 5檸檬酸鹽緩沖液），1. 2mL甘油，0· 2mL 0. 5M、pH5. 5的檸檬酸緩沖液。
[0026] 菌體細胞膽汁耐受性的測定方法：誘導4h的菌體細胞（菌體0D_nni值約為2. 0) 按4% (w/v)接種量轉接至含有0. 1% (w/v)豬膽鹽和5ng/mL(w/v)的GM17培養基中，于 30°C靜置培養，間隔一定時間測定菌體濃度（0D_nni值），制作生長曲線。
[0027] 本發明的有益效果是具有BSH1和BSH2活性的基因工程菌比野生菌的膽汁耐受能 力分別提高了近5和4倍，為開發具有較高膽汁耐受能力的益生菌制劑奠定了基礎。
【附圖說明】
[0028] 圖1 :目的基因的擴增。M :DL 2, 000 DNA Marker ;泳道1和泳道2 :bshl和bsh2 基因的PCR擴增條帶。
[0029]圖2 :蛋白電泳（SDS-PAGE)實驗結果。Μ :蛋白質分子量標準；1 :含有pNZ8148的 L. lactis NZ9000野生菌株細胞提取液；2 :經過Nisin誘導后的重組菌的細胞提取液。
[0030] 圖3 :重組菌中BSH對甘氨脫氧膽酸鈉（⑶CA)和牛磺脫氧膽酸鈉（TDCA)的活性 檢測。
[0031] 圖4 :重組菌與野生菌株膽汁耐受能力的比較。
【具體實施方式】
[0032] 實施例1重組菌的構建及鑒定
[0033] 1)從唾液乳酸桿菌Lactobacillus salivarius LMG14476提取基因組DNA作模 板，進行PCR擴增，引物為：
[0034] bshl-F :
[0035] 5' -ATTATAAGGAGGCACTCACCATGTG