多肽、支架組合物、軟骨組織修復用組合物、軟骨細胞培養用組合物及糖胺聚糖產生促進 ...的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及多肽、支架組合物、軟骨組織修復用組合物、軟骨細胞培養用組合物及 糖胺聚糖產生促進用組合物。
【背景技術】
[0002] 目前，謀求陷入功能障礙或功能衰竭的生物體組織或臟器再生的再生醫療的實用 化得到發展。再生醫療是使用細胞、支架及生長因子這三種因子重新構出僅通過生物體所 具有的自然治愈能力無法恢復的生物體組織并使其具有與原來的組織相同的形態或功能 的新的醫療技術。
[0003] 在再生醫療的領域中，為了補充由細胞進行的組織的修復或再生等，有時利用生 物親和性高的膠原或明膠。特別是有時在骨或皮膚等三維結構的組織的再生中使用膠原或 明膠，為了進行更良好的組織再生，對膠原或明膠進行了各種改良。
[0004] 已知軟骨、例如關節軟骨是由極少（2%左右）的軟骨細胞和細胞外基質構成的組 織，該細胞外基質由約70%的水分、約20%的膠原、約10%的蛋白多糖構成。細胞外基質 中蛋白多糖是由約95%的被稱為糖胺聚糖（GAG)的多糖類和約5%的蛋白質構成的糖蛋 白。在這樣的軟骨中，軟骨細胞被自身產生的膠原或蛋白多糖將周圍包圍而得到支撐。特 別是糖胺聚糖具有在軟骨基質內保持水分的作用，被認為是參與軟骨的退化抑制或修復的 物質。因此，作為軟骨細胞的支架材料，研宄了基于軟骨細胞的基質產生變得良好的支架材 料的開發。
[0005] 作為軟骨細胞的支架材料，以往使用天然II型膠原。
[0006] 另外，在日本特表號公報中，公開了涂敷有強化了細胞結合性的RGD 富集明膠樣蛋白的細胞支撐物，并記載了這樣的細胞支撐物可以在例如皮膚移植、創傷治 愈或者增強骨或軟骨的生長（再生）時使用。
[0007] 在國際公開第2008/133196號中，公開了具有作為細胞粘附信號的RGD序列的基 因重組明膠，并記載了能夠作為細胞粘附性基質使用。另外，在國際公開第2008/133196號 中，記載了在細胞治療的情況下，通常優選成為細胞的支架的細胞粘附性的基質材料，但記 載了在軟骨再生中，優選可耐受強度的基質。

【發明內容】

[0008] 發明所要解決的問題
[0009] 然而，如上述那樣，細胞外基質中GAG是大力參與軟骨細胞代謝的基質物質，但就 目前使用的天然II型膠原而言，在細胞外基質的產生促進的方面并不充分。另外，關于促進 基于軟骨細胞的基質產生的支架材料，以往是未知的。此外，關于從細胞外基質產生的觀點 出發可促進軟骨組織修復的軟骨組織修復用組合物及軟骨細胞培養用組合物、以及可良好 地促進細胞外基質中糖胺聚糖在細胞中的產生的組合物，也尚未得到提供。
[0010] 因此，本發明的課題在于提供軟骨細胞的細胞外基質產生促進優異的支架組合 物、軟骨組織修復用組合物、軟骨細胞培養用組合物及糖胺聚糖產生促進用組合物以及用 于它們的材料。
[0011] 用于解決問題的方法
[0012] 本發明如下。
[0013] [1] -種多肽，其具有每10kDa分子量的RGD序列的含有數為0.30個以上、每 10kDa分子量的GFPGER序列的含有數為0. 15個以上、每10kDa分子量的GVMGFP序列的含 有數低于〇. 30個的氨基酸序列。
[0014] [2]根據[1]所述的多肽，其總長的氨基酸殘基數為300~1400。
[0015] [3]根據[1]或[2]所述的多肽，其與天然人II型膠原的氨基酸序列的同源性達到 85%以上。
[0016] [4]根據[1]~[3]中任一項所述的多肽，其分子量為30kDa~80kDa。
[0017] [5]根據[1]~[4]中任一項所述的多肽，其等電點（pi)為6.0以下。
[0018] [6]根據[1]~[5]中任一項所述的多肽，其為重組肽。
[0019][7] -種多肽，其為下述（A)、⑶或（C)的多肽：
[0020] (A)具有序列號1~3所示的氨基酸序列的多肽，
[0021] (B)具有在序列號1~3所示的氨基酸序列中缺失、替換或附加了 1個或多個氨基 酸的氨基酸序列，且具有糖胺聚糖產生促進能力的多肽，
[0022] (C)具有與序列號1~3所示的氨基酸序列的序列同源性為80%以上的氨基酸序 列，且具有GAG產生促進能力的多肽。
[0023] [8] -種多肽，其具有與序列號1~3所示的氨基酸序列的序列同源性為90%以 上的氨基酸序列，且具有糖胺聚糖產生促進能力。
[0024] [9] 一種多肽，其具有與序列號1~3所示的氨基酸序列的序列同源性為95%以 上的氨基酸序列，且具有糖胺聚糖產生促進能力。
[0025][10]-種支架組合物，其包含[1]~[9]中任一項所述的多肽。
[0026] [11] 一種軟骨組織修復用組合物，其包含[1]~[9]中任一項所述的多肽。
[0027] [12] -種軟骨細胞培養用組合物，其包含[1]~[9]中任一項所述的多肽。
[0028] [13] -種糖胺聚糖產生促進用組合物，其包含[1]~[9]中任一項所述的多肽。
[0029] [14] [1]~[9]中任一項所述的多肽在支架組合物的制造中的用途。
[0030] [15] [1]~[9]中任一項所述的多肽在軟骨組織修復用組合物的制造中的用途。
[0031] [16] [1]~[9]中任一項所述的多肽在軟骨細胞培養用組合物的制造中的用途。
[0032] [17] [1]~[9]中任一項所述的多肽在糖胺聚糖產生促進用組合物的制造中的用 途。
[0033] [18]-種軟骨的損傷的修復或再生方法，其包含將[11]所述的軟骨組織修復用 組合物投與給軟骨的損傷部位。
[0034] 發明效果
[0035] 根據本發明，能夠提供軟骨細胞的細胞外基質產生促進優異的支架組合物、軟骨 組織修復用組合物、軟骨細胞培養用組合物及糖胺聚糖產生促進用組合物以及用于它們的 材料。
【附圖說明】
[0036] 圖1是表示基于實施例及比較例的各多肽的GAG產生促進能力評價的結果的圖 表。
【具體實施方式】
[0037] 本發明中的多肽為具有每10kDa分子量的RGD序列的含有數為0.30個以上、每 10kDa分子量的GFPGER序列的含有數為0. 15個以上、每10kDa分子量的GVMGFP序列的含 有數低于〇. 30個的氨基酸序列的多肽。
[0038] 本發明中，通過具有上述構成，在軟骨細胞與本發明的多肽接觸時可促進基于軟 骨細胞的細胞外基質、特別是糖胺聚糖（以下，有時稱為GAG。）的產生。
[0039] 即，例如為了比天然II型膠原更加促進GAG的產生，RGD序列及GFPGER序列需要 分別存在上述規定的含有數以上，另一方面，GVMGFP序列在多肽整體中需要每10kDa分子 量為〇或不超過〇. 30個。另外，本發明中，通過滿足RGD序列、GFPGER序列及GVMGFP序列 的含有數的上述的關系，可促進基于軟骨細胞的GAG產生。此外推測，在與本發明的多肽接 觸后的軟骨細胞的周邊存在豐富的GAG，可得到軟骨細胞的優異的增殖或生長。但是，本發 明并不限于這些理論。
[0040] 以下，有時將本發明的多肽稱為"特定多肽"。
[0041] 以下，對本發明進行說明。
[0042] 本說明書中"工序"這一用語不僅包括獨立的工序，在無法與其他工序明確區別的 情況下只要可達成該工序所期望的目的，也就包含在本用語中。
[0043] 另外，本說明書中使用"~"表示的數值范圍表示包含"~"的前后記載的數值分 別作為最小值及最大值的范圍。
[0044] 此外，本說明書中，關于組合物中各成分的量，在組合物中存在多種屬于各成分的 物質的情況下，只要沒有特別說明，是指組合物中存在的該多種物質的合計量。
[0045] 本發明中，有時將氨基酸序列中的氨基酸殘基用本技術領域中公知的單字母表 述（例如，在甘氨酸殘基的情況下為"G"）或三字母表述（例如，在甘氨酸殘基的情況下為 "Gly"）來表示。
[0046] 本發明中，關于多肽的氨基酸序列的" ％ "只要沒有特別說明，則以氨基酸（或亞 氨基酸）殘基的個數為基準。
[0047] 本說明書中，對氨基酸序列的特定的氨基酸殘基使用的"對應的氨基酸殘基"等表 述意味著表示，將進行對比的2個以上的氨基酸序列通過該技術領域中公知的方法在考慮 到插入、缺失、及替換的基礎上，按照相同的氨基酸殘基成為最多的方式排列（對齊）時，與 作為基準的氨基酸序列中的特定的氨基酸殘基的位置一致的另一氨基酸序列中的氨基酸 殘基。
[0048] 本發明中，關于對比的2種多肽的氨基酸序列的"同源性"是指通過以下的式子計 算得到的值。另外，多個多肽的對比（對齊）按照相同的氨基酸殘基的數目成為最多的方 式根據常規方法來進行。
[0049] 另外，作為關于重組的多肽的同源性的判斷，按照同源性成為最高的方式，將所對 比的2種多肽分別分成達到10個氨基酸殘基以上的任意的片段，使來自一個多肽的片段與 來自所對比的另一個多肽的片段之間對應，在對應了的片段間將氨基酸序列進行比較、綜 合，求出同源性。另外，關于包含多個重復序列（10個氨基酸殘基以上的序列）的多肽，將 第2個以上的重復的部分除去，求出對應的部分的同源性（％ )。
[0050] 同源性（％)=[(相同的氨基酸殘基的數目V(對齊長度）]x 100
[0051] [特定多肽]
[0052] 本發明的特定多肽具有每10kDa分子量的RGD序列的含有數為0. 30個以上、每 10kDa分子量的GFPGER序列的含有數為0. 15個以上、每10kDa分子量的GVMGFP序列的含 有數低