一種tRNASer(UCN)基因檢測方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物工程技術領域，具體設及一種非綜合征性耳聾相關的線粒體 tRNASerWCN)基因A7445C突變檢測方法及試劑盒的應用。
【背景技術】
[0002] 耳聾是影響人們正常生活的常見疾病，新生兒中患有先天性耳聾的比例約為千分 之一，而有60%W上的先天性耳聾患者是由遺傳因素引起的。根據除耳聾W外是否有其他 并發癥，可W將遺傳性耳聾分為綜合征性耳聾和非綜合征性耳聾，前者在遺傳性耳聾中約 占30%，后者所占比例約為70%。
[0003] 線粒體是一種由兩層膜包被的細胞器，是細胞內氧化憐酸化和合成Ξ憐酸腺巧 (AT巧的主要場所，為細胞的活動提供能量，所W有"細胞動力工廠"之稱。除了為細胞供能 夕F，線粒體還參與如細胞分化、細胞信息傳遞和細胞調亡等過程，并擁有調控細胞生長和細 胞周期的能力。
[0004] 線粒體DNA，尤其是12SrRNA和tRNASerWCN)基因是與耳聾相關的基因突變熱點 區域。2006年GuanMX等人發現，tRNASerWCN)A7445C突變可能與非綜合征性耳聾相關。
[0005] 目前對于突變檢測最常用方法為第一代測序技術，但此技術對儀器要求高，操作 繁瑣且成本昂貴，結果誤差大、敏感性差并且存在放射性核素污染；PCR-限制性片段長度 多態性（PCR-RFL巧是目前應用較廣泛、相對成熟的檢測方法，但操作繁瑣，操作過程中影 響結果的不確定因素太多；近年來，變性高效液相色譜值HHX)和基因忍片的應用為點突 變檢測提供了思路，檢測技術靈敏度和特異度均較高，自動化程度高，適合高通量檢測，但 設及儀器昂貴，需專人操作，不適合廣泛推廣。因此，迫切需要一種快速、準確、操作簡易的 突變篩查方法應用與臨床突變篩查。
[0006] 中國專利CN201310172063. 0公開了一種檢測耳聾相關的線粒體DNAT7505C突變 的試劑盒，由DNA提取混合液、擴增T7505C片段的PCR混合液、針對T7505C設計的一對外 引物、針對T7505C設計的一對內引物、限制性內切酶、陽性對照、陰性對照和盒體組成。但 是該方法在操作過程中存在雜合突變、膠壓縮、GC富集區的等問題，很難通過一次測序獲得 精確的數據。
[0007] 中國專利CN200910050224. 2公開了一種線粒體基因耳聾相關新突變12201T>C 所在序列具有序列1的結構；采用線粒體基因耳聾相關新突變對耳聾患者進行線粒體突變 位點優先檢測，有助于排除或診斷線粒體基因突變導致的耳聾；可采用線粒體基因耳聾相 關新突變制備診斷探針、引入突變造成酶切位點的引物和試劑盒，能簡便快捷的進行線粒 體相關耳聾的篩查。但是該利用該結構進行檢測時，操作復雜、耗時較長，且儀器設備昂貴。

【發明內容】

[0008] 本發明所要解決的技術問題在于：提供了一種操作簡便、易掌握的tRNASeHUCN) 基因檢測方法及應用，對儀器設備及操作人員無特殊要求，適合在一般醫院、分子生物實驗 室開展，為全國性開展非綜合征性耳聾相關的線粒體tRNASerWCN) 7445A乂突變的大規模 篩查和預防性檢查提供條件。
[0009] 為解決上述技術問題，本發明提供了一種線粒體tRNASerWCN)基因A7445C突變 檢測試劑盒，所述試劑盒包括：提取樣本全基因組DNA的試劑、PCR擴增反應試劑和酶切反 應試劑。
[0010]所述提取樣本全基因組DNA的試劑可W進一步包括：裂解液、溶液I、酪-氯 仿-異戊醇混合液和溶液II;所述溶液I為蛋白酶K溶液，溶液II為氨氧化鋼溶液； W11] 所述PCR擴增反應試劑還可W進一步包括：dNTP、10XPCR緩沖液、MgC12、引物、 Taq酶和Ξ蒸水；
[0012] 所述酶切反應試劑還可W進一步包括：限制性內切酶甜alMIX體系和Ξ蒸水。
[0013] 所述引物序列優選為：
[0014]SerWCN)F5，-ACGCCAAAATCCATTTCACT-3 '
[0015]SeHUCN)R5，-CGGGAATTGCATCTGTTTTT-3，。
[0016] 為解決上述技術問題，本發明還提供了一種線粒體tRNASeHUCN)基因A7445C突 變檢測中使用的引物，所述引物特異性的擴增包含7445位點的序列，并且擴增的序列中不 含有其它TCTAGA回文結構。
[0017] 為解決上述技術問題，本發明又提供了一種線粒體tRNASeHUCN)基因A7445C突 變檢測中使用的引物，所述引物中無連續出現的5個同一堿基，GC含量為40%，無引物二聚 體和發夾結構，設計引物人工合成。
[0018] 為解決上述技術問題，本發明再提供了一種線粒體tRNASeHUCN)基因A7445C突 變的檢測方法，所述方法包括：
[0019]步驟SO 1，提取全基因組DNA;
[0020]步驟S02，特異性PCR擴增及酶切；
[0021] 步驟S03,突變鑒定。
[0022] 所述步驟S02,特異性PCR擴增及酶切，可W進一步包括：采用專一性限制性內切 酶甜al在一對Ser(UCN)F和Ser(UCN)R引物的配合下，對樣本的全基因組DNA進行PCR擴 增和酶切；
[0023] 所述Ser〇JCN)F和Ser〇JCN)R引物的擴增優選包含7445位點的序列，且擴增的序 列中不含有其它TCTAGA回文結構；
[0024] 所述檢測方法優選利用特異性PCR擴增技術和專一性限制性內切酶Xbal特異性 的識別TCTAGA回文結構的特性，每份DNA樣本通過一次特異性的PCR反應和一次酶切反應 進行檢測。
[00巧]為解決上述技術問題，本發明又提供了一種前述任一項線粒體tRNASeHUCN)基 因A7445C突變檢測中使用的引物在制備檢測試劑盒中的應用。
[00%] 所述步驟SOI，提取全基因組DNA，可W進一步包括：運用蛋白酶K消化裂解蛋白 質，然后采用酪-氯仿-異戊醇法從細胞/血液/組織樣本中提取全基因組DNA。
[0027] 述步驟S03,突變鑒定，可W進一步包括：將酶切后的產物進行聚丙締酷胺凝膠電 泳，根據酶切后產生的DNA片段大小不同，檢測線粒體tRNASerWCN)基因7445位點突變狀 況。
[0028] 本發明有益的技術效果在于：
[0029] 1.本發明的所用標本血液、尿液、組織等采集后仍可用于后續實驗研究，如血液樣 本可建立永生化類淋己母細胞系、尿液細胞可用于成纖維細胞培養、組織可用于誘導多功 能干細胞的建立，可保存珍貴的遺傳資源。
[0030] 2.本發明試劑盒借助特異性PCR技術與專一性限制性內切酶甜al特異性的 識別TCTAGA回文結構的特點，每份DNA樣本用1對特異性引物進行PCR擴增，然后用專 一性限制性內切酶Xbal進行1次酶切即可在幾小時內對非綜合征性耳聾相關的線粒體 tRNASeHUCN)基因A7445C突變進行檢測。
[0031] 3.與其他檢測方法相比，本發明檢測方法操作簡便、易掌握；對儀器設備及操作 人員無特殊要求，適合在一般醫院、分子生物實驗室開展，為全國性開展非綜合征性耳聾相 關的線粒體tRNASeHUCN)7445A乂突變的大規模篩查和預防性檢查提供條件。
【附圖說明】
[0032]圖1為本發明實施方式所述的特異性條帶擴增循環條件圖；
[0033] 圖2為本發明實施方式所述突變樣本、對照樣本PCR產物及酶切產物圖；
[0034] 圖3為本發明實施方式所述突變樣本、對照樣本測序峰圖；
[0035] 圖4為本發明檢測方法流程示意圖。
【具體實施方式】
[0036]W下將結合實施方式來詳細說明本發明的實施方式，借此對本發明如何應用技術 手段來解決技術問題，并達成技術效果的實現過程能充分理解并據W實施。
[0037] 需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實施方式及實施方式中的特征可 W相互組合。
[0038] 本發明通過酶切法進行非綜合征性耳聾相關的線粒體tRNASerWCN) 7445A乂突 變檢測，克服了現有方法耗時長、操作難、成本高等缺點，提供非綜合征性耳聾相關的線粒 體tRNASerWCN) 7445A乂突變檢測試劑盒，W及該方法或該的試劑盒在檢測與非綜合征性 耳聾相關的線粒體tRNASerWCN) 7445A乂突變檢測中的應用。
[0039] 本發明的一實施方式中，提供了一種線粒體tRNASeHUCN)基因A7445C突變檢測 試劑盒，所述試劑盒包括：提取樣本全基因組DNA的試劑、PCR擴增反應試劑和酶切反應試 劑。
[0040]所述提取樣本全基因組DNA的試劑可W進一步包括：裂解液、溶液I、酪-氯 仿-異戊