一種診斷骨性關節炎致病風險的甲基化檢測試劑的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物醫藥技術領域，具體設及一種診斷骨性關節炎致病風險的甲基化 檢測試劑，更具體的設及MED1化基因、MED1化基因的甲基化檢測及其在診治骨性關節炎中 的應用。
【背景技術】
[0002] 骨性關節炎（Osteoarthritis,OA)是一種W關節軟骨退行性病變和關節周圍骨 質增生為主要病理特征的慢性進行性骨關節病，是多因素導致的疾病，除了生活習慣、自身 體質外，它還受很多基因及環境因子的影響。骨性關節炎的病理變化主要是關節軟骨的退 變及軟骨細胞外基質的改變。軟骨細胞正常基因調控模式越來越受到人們關注，它的改變 促進骨關節炎的發生和發展。近年來，表觀遺傳學在骨關節炎的發生發展中的作用越來越 受到人們的關注。
[0003] DNA甲基化是表觀遺傳學的重要組成部分，在維持正常細胞功能、遺傳印記、胚胎 發育W及腫瘤發生中起著重要作用，是目前研究熱點之一。DNA甲基化是在DNA甲基轉移酶 催化作用下，利用S-腺巧甲硫氨酸提供甲基，在CpG二核巧酸中胞喀晚的喀晚環的五號碳 原子上加上甲基的共價修飾過程。DNA甲基化能關閉某些基因的活性，去甲基化則可誘導基 因的重新活化和表達。甲基化位點可隨DNA的復制而遺傳，因為DNA復制后，甲基化酶可將 新合成的未甲基化的位點進行甲基化。
[0004] 本發明通過對5例骨性關節炎病人及2例對照的膝關節軟骨組織進行高通量甲基 化測序分析及轉錄組測序分析，篩選出幾個在病例組中呈高甲基化且基因表達下調的候選 基因及其甲基化位點。大樣本檢測時候選基因MEDl化在骨性關節炎患者膝關節軟骨組織 中低表達，同時該基因在患者膝關節軟骨組織中甲基化程度明顯高于正常組。本發明提供 了一種新的骨性關節炎診治祀點，具有重要的臨床應用價值。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的在于提供一種骨性關節炎診療試劑，所述診療試劑組分中的一種或 幾種用于檢測或降低序列表中SEQ ID NO. 3的CpG島甲基化程度。
[0006] 進一步，所述診療試劑組分中的一種或幾種用于檢測或降低序列表中SEQ ID NO. 3的第SObp處CpG島甲基化程度。
[0007] 優選的，采用BSP測序法對SEQ ID NO. 3的甲基化程度進行檢測，更優選的，采用 引物序列為序列表SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5進行BSP測序檢測。
[0008] 優選的，采用甲基化特異性PCR法對甲基化程度進行檢測，甲基化特異性PCR法包 括一對甲基化檢測引物和一對非甲基化檢測引物。
[0009] 進一步，采用下列方法中任意一種或幾種的組合對甲基化程度進行檢測：甲基化 敏感的限制性內切酶方法、NaHS〇3法、忍片技術方法；所述NaHSO3法包括BSP測序法、聯合 NaHS〇3限制性分析法、甲基化特異性PCR、巧光定量法；所述忍片技術方法包括甲基化高密 度忍片、差異甲基化雜交、甲基化特異性寡核巧酸忍片。
[0010] 本發明的目的在于提供上述診療試劑在制備骨性關節炎診療工具中的應用。
[0011] 本發明的目的在于提供一種檢測MEDl化基因的試劑在制備診斷骨性關節炎診斷 制劑中的應用。
[0012] 進一步，所述診斷制劑中含有檢測MEDl化基因表達量和/或檢測MEDl化基因甲 基化程度的試劑。
[0013] 優選的，采用下列方式中的一種或幾種檢測MEDl化基因表達量：巧光定量PCR試 劑盒、基因忍片、ELISA法和/或膠體金法，更優選的，采用引物序列為序列表SEQIDNO. 1 和SEQIDNO. 2進行MEDl化基因表達量檢測。
[0014] 本發明的目的在于提供一種治療骨性關節炎的制劑，所述制劑中含有促進MEDl化 基因的轉錄或表達的試劑或化合物。
[0015] 本領域人員熟知促進基因及其表達產物的表達通常可W采用下述方法中的一種 和/或幾種：激活MEDl化基因的啟動子、激活MEDl化基因表達的蛋白或因子、導入促進 MEDl化基因轉錄或表達的載體。
[0016] 本發明的目的在于提供一種檢測骨性關節炎的基因檢測試劑盒，所述試劑盒檢測 基因MED1：3L。
[0017] 本發明目的是提供了一種骨性關節炎蛋白檢測試劑盒，所述的檢測試劑盒檢測 MEDl化蛋白。進一步的，所述的試劑盒還包括其他檢測試劑。
[0018] 本發明目的是提供了一種檢測骨性關節炎的基因忍片，所述的基因忍片包括與 MEDl化基因的核酸序列雜交的探針。
[0019] 甲基化敏感的限制性內切酶方法是經典的甲基化分析方法，主要根據一些限制性 內切酶不能切開甲基化的DNA序列。由于在真核DNA或者哺乳動物DNA中，只有CG相連的 胞喀晚能夠被甲基化，因此，在酶切位點內包含CG序列的限制性內切酶就會遇到問題。運 種方法所使用的兩個經典酶對是HPaII-MspI(CCGG)和SmaI-XmaI(CCCGGG)。由于第二 對限制酶識別序列非常罕見，所W-般都用HPaII-MspI(CCGG)。兩個酶都識別CCGG序 列，而當其中的胞喀晚甲基化時，HPaII不能夠將其切開，利用化aII-Msp工的運種屬性處 理DNA，運就使得HPaII-MspI能夠作為快速甲基化分析的工具，隨后進行Southern或PCR 擴增分離立物，明確甲基化狀態。
[0020] NaHS〇3可將非甲基化的C轉化為U，后者經PCR擴增變成T而產生T:A配對，但甲 基化的C則能抵抗Na服〇3的修飾，運樣DNA包含的甲基化信息就可轉化為DNA序列的差異。 由此發展了多種CpG島甲基化檢測方法，如BSP測序、PCR(C0BRA，MSP，Metheli曲t等）、忍 片雜交技術（microarray)，此類方法適應于檢測己知基因中一個或多個CpG島的幾個CpG 位點的甲基化，屬位點特異性DNA甲基化檢測技術。
[0021] 忍片技術的發展為高通量研究DNA甲基化提供了新的方法。它的方法原理大致可 分為3種：（1)基于亞硫酸氨鹽處理后C/T轉變的原理，（2)基于甲基化敏感性內切酶或者 甲基化依賴性內切酶的方法，（3)基于5-甲基胞喀晚抗體或者MBD的免疫撲獲方法富集甲 基化的DNA片段。
[0022] 基因忍片又稱為DNA微陣列值NAmicroarray)，可分為S種主要類型：1)固定在 聚合物基片（尼龍膜，硝酸纖維膜等）表面上的核酸探針或CDNA片段，通常用同位素標記 的祀基因與其雜交，通過放射顯影技術進行檢測。2)用點樣法固定在玻璃板上的DM探針 陣列，通過與巧光標記的祀基因雜交進行檢測。3)在玻璃等硬質表面上直接合成的寡核巧 酸探針陣列，與巧光標記的祀基因雜交進行檢測。基因忍片作為一種先進的、大規模、高通 量檢測技術，應用于疾病的診斷，其優點有W下幾個方面：一是高度的靈敏性和準確性；二 是快速簡便；=是可同時檢測多種疾病。
[0023] 酶聯免疫吸附實驗巧LISA)即將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標 記的抗原抗體反應在固相表面進行的技術。該技術可用于檢測大分子抗原和特異性抗體 等，具有快速、靈敏、簡便、載體易于標準化等優點。ELISA檢測試劑盒根據檢測目的和操作 步驟可分為間接法、雙抗夾屯、法、競爭法、雙位點一步法、捕獲法測IgM抗體、應用親和素和 生物素的化ISA。ELISA檢測試劑盒中生色底物可選擇辣根過氧化物酶（HR巧或者堿性憐 酸酶（AF0。
[0024] 常用的免疫膠體金檢測技術：（1)免疫膠體金光鏡染色法細胞懸液涂片或組織切 片，可用膠體金標記的抗體進行染色，也可在膠體金標記的基礎上，W銀顯影液增強標記， 使被還原的銀原子沉積于已標記的金顆粒表面，可明顯增強膠體金標記的敏感性。（2)免疫 膠體金電鏡染色法可用膠體金標記的抗體或抗抗體與負染病毒樣本或組織超薄切片結合， 然后進行負染。可用于病毒形態的觀察和病毒檢測。（3)斑點免疫金滲濾法應用微孔濾膜 作載體，先將抗原或抗體點于膜上，封閉后加待檢樣本，洗涂后用膠體金標記的抗體檢測相 應的抗原或抗體。（4)膠體金免疫層析法將特異性的抗原或抗體W條帶狀固定在膜上，膠 體金標記試劑（抗體或單克隆抗體）吸附在結合墊上，當待檢樣本加到試紙條一端的樣本 墊上后，通過毛細作用向前移動，溶解結合墊上的膠體金標記試劑后相互反應，當移動至固 定的抗原或抗體的區域時，待檢物與金標試劑的結合物又與之發生特異性結合而被截留， 聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色結果。該法現已發展成為診斷試紙條，使用十分方 便。
【附圖說明】
[00巧]圖1骨性關節炎組和對照組中MEDl化基因甲基化情況
[0026] 圖2骨性關節炎患者組內MEDl化蛋白表達和基因甲基化相關性
【具體實施方式】
[0027] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明，僅用于解釋本發明，而不能理解為對本 發明的限制。本領域的普通技術人員可W理解：在不脫離本發明的原理和宗旨的情況下可 W對運些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發明的范圍由權利要求及其等同物限 定。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常