一種可溶性表達馬紅球菌致病基因VapA蛋白的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，更具體地，涉及一種可溶性表達馬紅球菌致病基因 VapA蛋白的方法。
【背景技術】
[0002] 馬紅球菌屬于紅球菌屬，是一種人畜共患的條件性致病菌。該病原菌普遍存在于 自然環境土壤中，調查表明，50~95%的農場土壤中存在該菌。馬紅球菌可感染人，導致呼 吸道感染癥狀。該病也是幼齡馬駒最常見的疾病之一，發病率可達80%。染病馬駒一般呈慢 性或亞急性支氣管肺炎癥狀，有時伴發盲結腸和腸系膜淋巴結潰瘍。
[0003] -直以來關于馬紅球菌的致病機制并不清楚，直至最近研宄發現，導致該細菌毒 性的關鍵是其是否含有一個致病性相關質粒。該質粒含有85~90kb的遺傳編碼DNA，可編 碼多個高免疫原性的毒性脂蛋白。其中，毒性相關蛋白A(VapA)為其主要表達蛋白。大量 研宄表明，馬紅球菌的毒性與Vap A密切相關。目前，雖有部分重組VapA蛋白表達的報道， 但其表達的蛋白多以包涵體的形式存在，較難應用于實際的醫療診斷和治療產品的開發和 應用。

【發明內容】

[0004] 本發明所要解決的技術問題是馬紅球菌致病基因 VapA蛋白多以包涵體形式存在 而無法獲得應用的技術缺陷，提供一種可溶性表達馬紅球菌致病基因 VapA蛋白的方法。
[0005] 本發明的目的是通過以下技術方案予以實現的： 一種可溶性表達馬紅球菌致病基因 VapA蛋白的方法，擴增VapA基因，并克隆到 PMAL-C5X載體上，構建表達載體PMAL-VapA，將PMAL-VapA轉化至原核表達菌，通過IPTG在 20°C下誘導獲得可溶性VapA蛋白。
[0006] 馬紅球菌致病基因 VapA蛋白是重要的毒性蛋白，現有技術中關于該蛋白研宄較 少。一般純化出的馬紅球菌致病基因 VapA蛋白多以包涵體的形式存在，從而限制了其實際 應用。申請人通過大量探索發現：將VapA基因與PMAL-C5X載體相連，并配合20°C的誘導 溫度可以表達出大量可溶性表達的VapA蛋白。
[0007] 本發明使用PMAL-C5X載體，它可以促進重組表達蛋白的可溶性表達，實驗研宄表 明，包涵體形式表達重組蛋白影響其氨基酸折疊形成正常的蛋白質三級、四級拓撲結構的 形成，進而影響重組表達蛋白的抗原性和生物活性。本研宄首次采用PMAL-C5X為載體，對 馬紅球菌的致病基因 VapA進行了重組，獲得重組質粒一PMAL-VapA。
[0008] 另外，發明人通過實驗發現，單單使用PMAL-C5x載體，對VapA蛋白的可溶性表達 雖然有促進作用，但作用并不明顯，還必須要配合低溫誘導，才能夠使VapA蛋白大量可溶 性表達，發明人研宄了多個誘導溫度對VapA蛋白的表達影響，結果顯示，只有在20°C時才 能夠獲得大量的可溶性的VapA蛋白。
[0009] 優選地，本發明所述原核表達菌在培養至〇D_值為0. 5~0. 7后，加入IPTG進行 誘導；更優選地，原核表達菌在培養至〇D_值為0. 6后，加入IPTG進行誘導 優選的，本發明所述IPTG誘導的濃度為0. 3~0. 7mM，誘導時間為8~12h。
[0010] 更優選地，申請人發現所述原核表達菌在20°C培養下，IPTG誘導濃度為0. 7mM，且 誘導時間為8h時，VapA蛋白的表達量最高，且多為可溶性表達。
[0011] 具體地，上述方法包括以下步驟： 51. 重組質粒PMAL-VapA的構建：設計SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所述引物擴增 VapA基因，將VapA基因與pZeroBack/blunt載體相連構建質粒pZeroBack-VapA ;最后將 PMAL-c5x和測序正確的pZeroBack-VapA進行雙酶切后構建表達載體PMAL-VapA ; 52. 將PML-VapA轉化入BL21菌中，測序鑒定為陽性之后，將菌液接種于培養基中， 培養至〇D_值為0. 5~0. 7,加入IPTG誘導后，離心重懸菌體，破碎菌體，收集上清，獲得可 溶性VapA蛋白。
[0012] S3.上清通過直鏈淀粉樹脂進行親和層析，獲得純化后的蛋白。
[0013] 更優選地，S2原核表達菌在培養至OD6cJ直為0. 6后，加入IPTG進行誘導。
[0014] 本發明還提供了上述方法得到的可溶性VapA蛋白。
[0015] 進一步地，還提供上述VapA蛋白制備得到的免疫制劑；具體地，所述免疫制劑為 抗免血清。
[0016] 與現有技術相比，本發明的有益效果如下： 本發明提供了一種可溶性表達馬紅球菌致病基因 VapA蛋白的方法，是將VapA基因克 隆到PMAL-C5X載體上，構建表達載體PMAL-VapA，并將PMAL-VapA轉化至原核表達菌，通過 IPTG在20°C下誘導獲得；以上述方法獲得的重組蛋白幾乎全部以可溶表達的形式存在。將 該重組蛋白純化后，濃度可達2mg/mL，該重組蛋白具有良好的免疫原性，更適于臨床治療用 高免血清抗體和疫苗的制備、臨床診斷試劑的開發和應用以及馬紅球菌致病機理的研宄。
【附圖說明】
[0017] 圖1為VapA基因的PCR擴增圖；其中，I :VapA ;2 :ddH20對照；M :2000bp的DNA分 子量標準。
[0018] 圖2為重組克隆質粒pZeroBack-VapA的酶切鑒定；其中，I :pZeroBack_VapA重組 質粒的及I和I雙酶切產物；M :5000bp的DNA分子量標準。
[0019] 圖3為重組表達質粒PMAL-VapA的測序鑒定結果；下劃線部位分別為Afoi I與 feo/P I的酶切位點序列。
[0020] 圖4為不同誘導溫度對蛋白表達量的影響；其中，M :蛋白分子量標準；I :IPTG誘 導前的蛋白表達；2-6:分別在10°〇、15°〇、20°〇、28°〇和37°〇溫度下誘導的蛋白表達。
[0021] 圖5為不同IPTG誘導時間對蛋白表達量的影響；其中，M :蛋白分子量標準；1-8分 別為IPTG誘導0、2、4、8、12、16、20和24小時的蛋白表達。
[0022] 圖6為不同IPTG濃度對誘導蛋白表達量的影響；其中，M :蛋白分子量標準；1-7 : IPTG 濃度分別為：0、0· 1、0· 3、0· 5、0· 7、1· 0 和 L 4 mM。
[0023] 圖7為20°C下0. 7mM IPTG誘導8h后表達的蛋白；其中，Μ:蛋白分子量標準；1 :誘 導前BL21細菌的蛋白表達；2 :誘導后BL21細菌的蛋白表達；3轉化空表達載體PMAL-C5X 的BL21誘導前蛋白表達；4 :轉化空表達載體PMAL-C5X的BL21誘導后蛋白表達；5 :轉化空 表達質粒PML-VapA的L21誘導前蛋白表達；6 :轉化表達質粒PML-VapA的BL21誘導后的 蛋白表達；7 :經親和層析純化后的VapA蛋白；8 :誘導表達VapA蛋白的BL21菌液超聲破碎 上清(含可溶性表達蛋白）;9 :誘導表達VapA蛋白的BL21菌液超聲破碎沉淀(含包涵體表達 蛋白）。
[0024] 圖8為不同溫度誘導表達的VapA蛋白的狀態分析；M :蛋白分子量標準；I :IPTG誘 導前轉化BL21 (含PML-VapA)的蛋白表達；2和3分別為：20°C誘導表達產物的超聲破碎 上清(含可溶性表達蛋白）和沉淀(含包涵體表達蛋白）;4和5分別為：28°C誘導表達產物的 超聲破碎上清和沉淀；6和7分別為：37°C誘導表達產物的超聲破碎上清和沉淀。
[0025] 圖9為純化后VapA蛋白的Western-blot分析結果；其中，1 :純化的VapA蛋白； M :蛋白分子量標準。
【具體實施方式】
[0026] 下面結合說明書附圖和具體實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本 發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的簡單 修改或替換，均屬于本發明的范圍；若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術 人員所熟知的常規手段。
[0027] 實施例1原核表達重組質粒PML-VapA的構建與鑒定 1、馬紅球菌的復蘇與培養：購買保藏于美國菌種保藏中心，保藏號為ATCC 33701的馬 紅球菌，按照規定操作流程復蘇馬紅球菌。
[0028] 2、引物設計：根據NCBI基因庫中馬紅球菌致病基因 VapA序列（JN990991. 1)以及 pZeroBack/blunt和PMAL-C5X載體酶切位點，運用0Ligo6. 0軟件，設計一對帶酶切位點的 引物（由上海英維捷基生物技術有限公司合成)，引物序列如下： F ：AAGGAAAAAAGCGGCCGCATGAAGACCCTGCACAAGACGGTCTC (下劃線為 AfoiI 酶切位點） R ：CCGGAATTCCTAAGCGTTGTGCCAACTACCCGAG (下劃線為 I 酶切位點）。
[0029] 3、VapA基因的PCR擴增與克隆 3. L參照Fast HiFideLity PCR Kit說明擴增VapA基因，反應體系如表1。
【主權項】
1. 一種可溶性表達馬紅球菌致病基因VapA蛋白的方法，其特征在于，擴增VapA基因， 并克隆到PMAL-C5X載體上，構建表達載體PMAL-VapA，將PMAL-VapA轉化至原核表達菌，通 過IPTG在20°C下誘導獲得可溶性VapA蛋白。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，將原核表達菌在培養至OD_值為0. 5~ 0.7后，加入IPTG進行誘導。
3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，IPTG誘導的濃度為0. 3~0. 7mM，誘導時 間為8~12h。
4. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于，IPTG誘導的濃度為0.7mM，誘導時間為 8h〇
5. 根據權利要求1至4任一項所述的方法，其特征在于，包括以下步驟：
51. 重組質粒PMAL-VapA的構建：設計SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所述引物擴增 VapA基因，將VapA基因與pZeroBack/blunt載體相連構建質粒pZeroBack-VapA ;最后將 PMAL-c5x和測序正確的pZeroBack-VapA進行雙酶切后構建表達載體PMAL-VapA ;
52. 將PML-VapA轉化入BL21菌中，測序鑒定為陽性之后，將菌液接種于培養基中， 培養至OD6cJ直為0. 5~0. 7后，加入IPTG誘導后，離心重懸菌體，破碎菌體，收集上清，獲 得可溶性VapA蛋白。
6. 權利要求1至4任一項所述的方法制備得到的可溶性VapA蛋白。
7. 由權利要求6所述VapA蛋白制備得到的免疫制劑。
8. 由權利要求6所述VapA蛋白制備得到的抗免血清。
【專利摘要】本發明屬于生物技術領域，具體公開了一種可溶性表達馬紅球菌致病基因VapA蛋白的方法，是將VapA基因克隆到PMAL-C5x載體上，構建表達載體PMAL-VapA，并將PMAL-VapA轉化至原核表達菌，通過IPTG在20℃下誘導獲得；以上述方法獲得的重組蛋白幾乎全部以可溶表達的形式存在。將該重組蛋白純化后，濃度可達2mg/mL，該重組蛋白具有良好的免疫原性，更適于臨床治療用高免血清抗體和疫苗的制備、臨床診斷試劑的開發和應用以及馬紅球菌致病機理的研究。
【IPC分類】C12N15-31, A61K39-02, C07K16-12, C12N15-70, A61P31-04
【公開號】CN104862331
【申請號】CN201510273219
【發明人】孫凌霜, 龔鳳平, 李守軍
【申請人】華南農業大學
【公開日】2015年8月26日
【申請日】2015年5月26日