本發明涉及(ji)生物醫藥領域，尤其一種環肽化合物及(ji)其制(zhi)備和應用。

背景技術：

糖(tang)(tang)(tang)尿(niao)病已成(cheng)為(wei)繼心血管疾病和(he)腫瘤之后的(de)(de)(de)第(di)三大威脅人類健康的(de)(de)(de)疾病。ⅱ型糖(tang)(tang)(tang)尿(niao)病是(shi)因為(wei)靶細胞對胰島素的(de)(de)(de)敏(min)感性降低(di)所致，導致餐后血糖(tang)(tang)(tang)水平高。α-葡(pu)(pu)萄(tao)糖(tang)(tang)(tang)苷酶(mei)抑制劑(ji)是(shi)目前臨(lin)床治療ⅱ型糖(tang)(tang)(tang)尿(niao)病的(de)(de)(de)一線口服降糖(tang)(tang)(tang)藥(yao)物（如阿卡波糖(tang)(tang)(tang)、伏(fu)格(ge)列波糖(tang)(tang)(tang)、米(mi)格(ge)列醇(chun)），它(ta)通(tong)過可(ke)逆(ni)性地抑制腸系膜刷狀緣(yuan)的(de)(de)(de)α-糖(tang)(tang)(tang)苷酶(mei)，延(yan)緩α-糖(tang)(tang)(tang)苷酶(mei)將(jiang)多糖(tang)(tang)(tang)分解為(wei)葡(pu)(pu)萄(tao)糖(tang)(tang)(tang)，從(cong)而(er)減慢(man)葡(pu)(pu)萄(tao)糖(tang)(tang)(tang)的(de)(de)(de)吸收速度，從(cong)而(er)降低(di)餐后血糖(tang)(tang)(tang)。

海洋天然產物作為藥物開發的重要來源，從中尋找新型α-葡萄糖苷酶抑制劑對發現高效低毒的治療ii型糖尿病藥物具有重要意義。近幾年來，從海洋天然產物中尋找α-葡萄糖苷酶抑制劑的研究越來越得到學者們的到重視，目前已經發現了45個海洋來源的天然α-葡萄糖苷酶抑制劑。為了尋找α-葡萄糖苷酶抑制劑，本發明人研究得知，海洋球孢枝孢菌cladosporiumsphaerospermumys3-1-5的(de)(de)發(fa)酵產(chan)物(wu)的(de)(de)粗提物(wu)具(ju)有(you)較好的(de)(de)α-葡(pu)萄(tao)糖苷酶(mei)抑制(zhi)(zhi)(zhi)活性，遂對其活性成分進行了研究(jiu)。研究(jiu)發(fa)現所(suo)示環肽(tai)化合(he)物(wu)具(ju)有(you)α-葡(pu)萄(tao)糖苷酶(mei)抑制(zhi)(zhi)(zhi)活性，目前尚(shang)未見該(gai)化合(he)物(wu)的(de)(de)化學(xue)結構(gou)及作為(wei)α-葡(pu)萄(tao)糖苷酶(mei)抑制(zhi)(zhi)(zhi)劑的(de)(de)報道，因(yin)此(ci)市場上也尚(shang)未見有(you)與(yu)此(ci)相關的(de)(de)藥物(wu)。

技術實現要素：

本發明所(suo)要解決(jue)的技術問題是提供一(yi)種環(huan)肽(tai)類(lei)的α-葡(pu)萄糖苷酶(mei)抑(yi)制劑(ji)及其制備(bei)方法和應用。

本發明(ming)解決上述(shu)技術問題所(suo)采(cai)用的技術方(fang)案為：

一種環肽化合物，含有1個亮(liang)氨酸殘(can)基(ji)、2個n甲基(ji)亮(liang)氨酸殘(can)基(ji)和一個苯丙氨酸殘(can)基(ji)構成的環四(si)肽化合物，其結(jie)構式如ⅰ所示(shi)：

（i）。

上述環(huan)肽化合物的(de)制備方法，具體包括如下步(bu)驟：

（1）發酵生產和浸膏(gao)的獲取

將保藏編號為cctccno：m2014098的球孢枝孢菌ys3-1-5（cladosporiumsphaerospermumys3-1-5）菌(jun)落接種到裝有液(ye)體培養基的(de)錐(zhui)形瓶(ping)中(zhong)，于28℃、180r/min搖床培養10天，獲得發酵(jiao)液(ye)，發酵(jiao)液(ye)用(yong)乙(yi)(yi)酸乙(yi)(yi)酯萃(cui)取3次，合并乙(yi)(yi)酸乙(yi)(yi)酯萃(cui)取液(ye)減(jian)壓濃縮蒸干，獲得粗浸膏；

（2）分離精制

將(jiang)上述(shu)粗浸(jin)膏用二(er)氯甲烷(wan)(wan)和(he)甲醇混(hun)合溶劑(ji)(ji)溶解后，加粗浸(jin)膏2倍體積的(de)200-300目硅膠拌(ban)樣(yang)，通過減壓硅膠柱(zhu)層析(xi)，以(yi)石油醚/乙(yi)酸(suan)乙(yi)酯為(wei)溶劑(ji)(ji)進行梯度洗(xi)脫(tuo)(tuo)，將(jiang)獲得的(de)洗(xi)脫(tuo)(tuo)物(wu)再經(jing)sephadexlh-20凝膠柱(zhu)層析(xi)以(yi)二(er)氯甲烷(wan)(wan)和(he)甲醇混(hun)合溶劑(ji)(ji)為(wei)洗(xi)脫(tuo)(tuo)劑(ji)(ji)進行洗(xi)脫(tuo)(tuo)，所得洗(xi)脫(tuo)(tuo)液再經(jing)反(fan)相(xiang)制備(bei)hplc分(fen)離純化(hua)，以(yi)甲醇/水(shui)(v/v90∶10)為(wei)流動(dong)相(xiang)進行分(fen)離純化(hua)得到環肽化(hua)合物(wu)(10mg)，其結構如式i所示：

（i）。

步驟(zou)（1）所述的液(ye)體培養基(ji)配制方法(fa)如下(xia)：將甘露醇10.0g，酵(jiao)母膏3.0g，麥(mai)芽糖20.0g，味(wei)精10.0g，葡萄糖20.0g，kh2po40.5g和mgso40.3g，溶(rong)于(yu)1l海(hai)水中(zhong)，于(yu)121℃高(gao)壓滅菌(jun)20min即(ji)可。

步驟(zou)（2）所述的(de)二氯甲(jia)烷(wan)和甲(jia)醇混合溶劑中二氯甲(jia)烷(wan)與(yu)甲(jia)醇的(de)體積比為1：1。

步驟（2）所述的(de)減壓硅膠柱的(de)大小為高20cm和(he)直徑4cm。

步(bu)驟（2）所述的石油(you)醚(mi)/乙(yi)酸(suan)乙(yi)酯中石油(you)醚(mi)與(yu)乙(yi)酸(suan)乙(yi)酯的體積比(bi)為8:1至5：1。

步驟（2）所述(shu)的(de)制備(bei)反(fan)相高(gao)效液相色譜的(de)洗脫(tuo)劑(ji)為甲醇與水按體積比(bi)90:10的(de)比(bi)例混(hun)合。

上述一種環(huan)肽化(hua)合(he)物的(de)(de)應用(yong)，所(suo)述的(de)(de)環(huan)肽化(hua)合(he)物在制備α-葡萄糖苷酶(mei)抑制劑(ji)方面(mian)的(de)(de)用(yong)途。

進(jin)一步所述的環肽(tai)化合物(wu)在制備治療糖尿病、肥胖(pang)癥藥方面的用途。

與現有技術相比，本發明的優點在于：本發明一種環肽化合物及其制備方法和應用，通過海洋球孢枝孢菌（cladosporiumsphaerospermumys3-1-5）發酵培養，然(ran)后將發酵產物(wu)(wu)用乙(yi)(yi)酸乙(yi)(yi)酯萃取(qu)獲得粗浸膏，將該(gai)粗浸膏經減壓硅膠柱層析(xi)、sephadexlh-20凝(ning)膠柱層析(xi)和反相(xiang)制(zhi)備高效液相(xiang)色譜分離純(chun)化(hua)(hua)得到一種(zhong)環(huan)肽化(hua)(hua)合(he)物(wu)(wu)，該(gai)方法具有(you)(you)成本低，繁殖周期(qi)短，提純(chun)工藝簡單等優點(dian)。所述環(huan)肽化(hua)(hua)合(he)物(wu)(wu)具有(you)(you)α-葡萄糖(tang)苷酶抑制(zhi)作用，與各種(zhong)藥物(wu)(wu)可接受的載體、賦形劑(ji)或輔料配(pei)伍，可以(yi)作為治(zhi)療糖(tang)尿病(bing)、肥(fei)胖癥的藥物(wu)(wu)先導(dao)化(hua)(hua)合(he)物(wu)(wu)。

上述球孢枝孢菌ys3-1-5cladosporiumsphaerospermumys3-1-5，于(yu)(yu)2014年(nian)3月(yue)21日(ri)保(bao)(bao)(bao)藏于(yu)(yu)中(zhong)(zhong)國典(dian)型(xing)培養物保(bao)(bao)(bao)藏中(zhong)(zhong)心，保(bao)(bao)(bao)藏編號為：cctccno:m2014098，保(bao)(bao)(bao)藏地址為中(zhong)(zhong)國.武漢.武漢大學。

具體實施方式

以下結(jie)合實施例(li)對本(ben)發明(ming)作進一步(bu)詳(xiang)細描(miao)述(shu)。

實施例1

一(yi)(yi)種環肽化合物，其結(jie)構(gou)(gou)特征是(shi)：含有(you)1個亮氨酸殘基、2個n甲基亮氨酸殘基和一(yi)(yi)個苯丙(bing)氨酸殘基構(gou)(gou)成的環四(si)肽化合物，結(jie)構(gou)(gou)式如ⅰ所示(shi)：

（i）。

實施例2

如i式所示的(de)環肽(tai)化合物的(de)制備方法(fa)，具體包括(kuo)如下步(bu)驟(zou)：

（1）發(fa)酵生(sheng)產和浸膏(gao)的獲(huo)取

將保藏編號為cctccno：m2014098的球孢枝孢菌（cladosporiumsphaerospermumys3-1-5）菌落接種到(dao)裝有(you)300ml液體培養基（甘露醇(chun)10.0g，酵(jiao)母膏3.0g，麥芽(ya)糖(tang)20.0g，味精(jing)10.0g，葡萄糖(tang)20.0g，kh2po40.5g，mgso40.3g和海水1l）的(de)1l錐形瓶(ping)中（共(gong)100瓶(ping)），于28℃、180r/min搖床培養10天，獲得發酵(jiao)液，發酵(jiao)液用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液減壓濃縮(suo)蒸(zheng)干(gan)，獲得粗浸(jin)(jin)膏（共(gong)100瓶(ping)獲得20g粗浸(jin)(jin)膏）；

（2）分離精制

將(jiang)上述粗浸膏（20g）用二(er)氯甲(jia)(jia)烷(wan)和(he)甲(jia)(jia)醇(chun)混合溶(rong)劑(ji)（其中二(er)氯甲(jia)(jia)烷(wan)與(yu)甲(jia)(jia)醇(chun)的體積(ji)比(bi)為1：1）溶(rong)解(jie)后(hou)，加40克200-300目硅(gui)膠(jiao)拌樣，通過減(jian)壓(ya)硅(gui)膠(jiao)柱（柱大小為高20cm和(he)直(zhi)徑4cm）層(ceng)析(xi)，以體積(ji)比(bi)8:1至5:1的石油醚/乙酸乙酯(zhi)為溶(rong)劑(ji)進(jin)行梯度洗(xi)(xi)脫，獲得洗(xi)(xi)脫物再經sephadexlh-20凝膠(jiao)柱層(ceng)析(xi)以甲(jia)(jia)醇(chun)/二(er)氯甲(jia)(jia)烷(wan)為洗(xi)(xi)脫劑(ji)(甲(jia)(jia)醇(chun)與(yu)二(er)氯甲(jia)(jia)烷(wan)的體積(ji)比(bi)為1∶1)進(jin)行洗(xi)(xi)脫，所(suo)得洗(xi)(xi)脫液再經反相制(zhi)備hplc分(fen)離純化(hua)(hua)，以甲(jia)(jia)醇(chun)/水(v/v90∶10)為流動相進(jin)行分(fen)離純化(hua)(hua)得到環肽(tai)化(hua)(hua)合物(10mg)，其結(jie)構如(ru)式(shi)i所(suo)示：

（i）。

該化合物ⅰ，白色粉末，分子式c29h46n4o4，陽離子hresimsm/z：515.3590[m+h]⁺，¹h和¹³c-nmr數據見表(biao)1。

表1化合物ⅰ的¹h和¹³cnmr數據（500和125mhz，indmso-d6）

實施例3

α-葡(pu)萄(tao)糖苷酶(mei)抑制活性的測試(shi)（96孔板法）

（1）實驗樣品

被(bei)測樣品(pin)溶液的配制：測試樣品(pin)為(wei)上述實施例1中分離純(chun)化的化合物ⅰ純(chun)品(pin)，精密稱取適量(liang)樣品(pin)，配制成所需(xu)濃度(du)的溶液，供(gong)測活性(xing)。

（2）實驗方法

以4-硝(xiao)基苯-α-d-吡(bi)喃葡(pu)萄糖(tang)苷為(wei)(wei)底物(wu)，在96孔酶標板(ban)上反(fan)應，最終反(fan)應體積為(wei)(wei)200μl，測(ce)定(ding)α-葡(pu)葡(pu)萄糖(tang)苷酶抑制活性(xing)。將不(bu)同濃度的樣(yang)(yang)品溶(rong)(rong)液（40μl）加入到40μl0.04u/mlα-葡(pu)萄糖(tang)苷酶溶(rong)(rong)液中(zhong)，于(yu)37℃下反(fan)應5min，加入20μl0.5mmol/l4-硝(xiao)基苯-α-d-吡(bi)喃葡(pu)萄糖(tang)苷溶(rong)(rong)液，于(yu)37℃反(fan)應30min后，用(yong)100μl0.1mol/lna2co3溶(rong)(rong)液終止反(fan)應，在405nm波長處測(ce)定(ding)溶(rong)(rong)液的吸收值(zhi)。阿卡波糖(tang)作(zuo)為(wei)(wei)陽性(xing)對照。樣(yang)(yang)品對酶活性(xing)的抑制率(%)按下式(shi)計算:

抑制率(%)=［ablank－(a0－a)］/ablank×100%式中，ablank為(wei)不加待測(ce)樣(yang)(yang)品溶液的吸(xi)收值(zhi)(zhi)；a0為(wei)加入待測(ce)樣(yang)(yang)品反(fan)應后溶液的吸(xi)收值(zhi)(zhi)；a為(wei)只加待測(ce)樣(yang)(yang)品溶液的吸(xi)收值(zhi)(zhi)。

（3）實驗結果

當化合物ⅰ在(zai)0.5mg/ml的(de)(de)濃度時(shi)對α-葡葡萄糖苷酶的(de)(de)抑制活性(xing)可達(da)(da)78.2%，當為1mg/ml時(shi)可達(da)(da)90%，而阿卡波糖在(zai)1mg/ml時(shi)，僅為85%。

由此(ci)可(ke)知化(hua)(hua)合(he)物(wu)ⅰ對α-葡葡萄(tao)糖苷酶較好的抑(yi)制作用，可(ke)作為α-葡葡萄(tao)糖苷酶抑(yi)制劑，用于治療糖尿(niao)病、肥胖(pang)癥的藥物(wu)先導化(hua)(hua)合(he)物(wu)。

上述說明(ming)(ming)并(bing)非對(dui)本(ben)發明(ming)(ming)的(de)限(xian)制(zhi)，本(ben)發明(ming)(ming)也并(bing)不限(xian)于上述舉(ju)例。本(ben)技術(shu)領域的(de)普通技術(shu)人員(yuan)在本(ben)發明(ming)(ming)的(de)實質范圍內(nei)，作出(chu)的(de)變化、改型、添加(jia)或替換，也應屬于本(ben)發明(ming)(ming)的(de)保護范圍。