0041]實驗結果:融合蛋白典型多電荷TIC圖見附圖1，去卷積化完整蛋白分子量分析結果見附圖2。
[0042]實施例2:融合蛋白完整分子量分析(先唾液酸去除，然后N-糖去除)
[0043]融合蛋白完整分子量分析步驟:
[0044](I)唾液酸去除
[0045]取50 μ g Etanercept融合蛋白樣品，加入50mM NH4HCO3 (pH8.0)溶液至體積20 μ L，用I % FA調節pH值至5?6，加入唾液酸酶Neuraminidase 0.5 μ L, 37°C孵育24小時。
[0046](2) N-糖去除
[0047]將⑴中孵育好的樣品，用I % NH3.H2O調節pH值至7?8，加入I μ L 4倍稀釋的PNGase 卩(陬8，50000011/1^)，371:孵育 24 小時。
[0048](3) ES1-Q-TOF MS 分析
[0049]脫N-糖脫唾液酸的融合蛋白采用50mM NH4HCO3 (pH8.0)溶液稀釋至lmg/mL ;然后MassPREPTM Micro Desalting Column 2.1 X 5mm 脫鹽柱脫鹽,最后質譜分析。
[0050]實驗結果:融合蛋白典型多電荷TIC圖見附圖3，去卷積化完整蛋白分子量分析結果見附圖4。
[0051]實施例3:脫N-糖后不同pH條件下脫唾液酸去卷積化完整蛋白分子量分析對比
[0052]融合蛋白完整分子量分析步驟:
[0053](I) N-糖去除
[0054]取400 μ g Etanercept融合蛋白樣品，加入50mM NH4HCO3 (pH8.0)溶液至體積160yL，加入2yL PNGase F，混勻后，37°C孵育24小時。
[0055](2)唾液酸去除
[0056]將⑴中孵育好的樣品取4份，每份50 μ g，用1% FA分別調節pH值至4、5、6、7，均加入唾液酸酶Neuraminidase 0.5 μ L, 37°C孵育24小時。
[0057](3) ES1-Q-TOF MS 分析
[0058]脫N-糖與脫唾液酸的融合蛋白采用50mM NH4HCO3 (pH8.0)溶液稀釋至lmg/mL ;然后 MassPREPTM Micro Desalting Column 2.1 X 5mm 脫鹽后，質譜分析。
[0059]實驗結果:脫N-糖后不同pH條件下脫唾液酸去卷積化完整蛋白分子量對比分析結果見附圖5-7。
[0060]實施例:4:N-糖去除后不調節緩沖液pH值進行唾液酸去除對融合蛋白完整分子量分析的影響
[0061]融合蛋白完整分子量分析步驟:
[0062](I) N-糖去除
[0063]取50ug Etanercept 融合蛋白樣品，加入 50mM NH4HCO3 (ρΗ8.0)溶液至體積 20 μ L,加入I μ L 4倍稀釋的PNGase F，混勻后，37°C孵育24小時。
[0064](2)唾液酸去除
[0065]將⑴中孵育好的樣品，加入唾液酸酶Neuraminidase 0.5 μ L，37°C孵育24小時。
[0066](3) ES1-Q-TOF MS 分析
[0067]脫N-糖脫唾液酸的融合蛋白采用50mM NH4HCO3 (pH8.0)溶液稀釋至lmg/mL ;然后MassPREPTM Micro Desalting Column 2.1 X 5mm 脫鹽后，質譜分析。
[0068]實驗結果:融合蛋白去卷積化完整蛋白分子量分析結果見附圖8。
[0069]實施例5:唾液酸去除后不調節緩沖液pH值進行N-糖去除對融合蛋白完整分子量分析的影響
[0070]融合蛋白完整分子量分析步驟:
[0071](I)唾液酸去除
[0072]取50 μ g Etanercept融合蛋白樣品，加入50mM NH4HCO3溶液至體積20 μ I,加入唾液酸酶 Neuraminidase 0.5 μ L, 37°C孵育 24 小時。
[0073](2) N-糖去除
[0074]將⑴中孵育好的樣品，加入I μ L 4倍稀釋的PNGase F，37°C孵育24小時。
[0075](3) ES1-Q-TOF MS 分析
[0076]脫唾液酸脫N-糖的融合蛋白采用50mM NH4HCO3 (pH8.0)溶液稀釋至lmg/mL ;然后MassPREPTM Micro Desalting Column 2.1 X 5mm 脫鹽后，質譜分析。
[0077]實驗結果:融合蛋白去卷積化完整蛋白分子量分析結果見附圖9。
[0078]實施例:6:不進行唾液酸去除對融合蛋白分子量分析的影響
[0079]融合蛋白完整分子量分析步驟:
[0080](I) N-糖去除
[0081]取50yg Etanercept融合蛋白樣品，加入50mM NH4HCO3溶液至體積20 μ L,加入I μ L 4倍稀釋的PNGase F，混勻后，37°C孵育24小時。
[0082](2) ES1-Q-TOF MS 分析
[0083]脫N-糖的融合蛋白采用50mM NH4HCO3 (pH8.0)溶液稀釋至lmg/mL ；然后MassPREPTM Micro Desalting Column 2.1 X 5mm 脫鹽后，質譜分析。
[0084]實驗結果:融合蛋白典型多電荷TIC圖見附圖10，去卷積化完整蛋白分子量分析結果見附圖11。
[0085]實施例7:不進行N-糖去除對融合蛋白的分子量分析的影響
[0086]融合蛋白完整分子量分析步驟:
[0087](I)唾液酸去除
[0088]取50 μ g Etanercept融合蛋白樣品，加入50mM NH4HCO3溶液至體積20 μ I,加入唾液酸酶 Neuraminidase 0.5 μ L, 37°C孵育 24 小時。
[0089](2) ES1-Q-TOF MS 分析
[0090]脫唾液酸的融合蛋白采用50mM NH4HCO3 (pH8.0)溶液稀釋至lmg/mL ；然后MassPREPTM Micro Desalting Column 2.1 X 5mm 脫鹽后，質譜分析。
[0091]實驗結果:融合蛋白典型多電荷TIC圖見附圖12，去卷積化完整蛋白分子量分析結果見附圖13。
[0092]實施例8:融合蛋白rhCTLA4_Ig完整分子量分析(先N-糖去除，然后唾液酸去除)
[0093]融合蛋白完整分子量分析步驟:
[0094](I) N-糖去除
[0095]取50 μ g rhCTLA4-1g融合蛋白樣品(百時美施貴寶有限公司)，加入50mM NH4HCO3溶液至體積20 μ L，加入I μ L 4倍稀釋的PNGaseF，混勻后，37°C孵育24小時。
[0096](2)唾液酸去除
[0097]將(I)中孵育好的樣品，加入唾液酸酶Neuraminidase 0.5 μ L，37°C孵育24小時。
[0098](3) ES1-Q-TOF MS 分析
[0099]脫唾液酸的rhCTLA4-1g融合蛋白采用50mM NH4HCO3 (pH8.0)溶液稀釋至lmg/mL ；然后 MassPREPTM Micro Desalting Column 2.1 X 5mm 脫鹽后，質譜分析。
[0100]實驗結果:rhCTLA4-1g融合蛋白典型多電荷TIC圖見附圖14去卷積化典型完整蛋白分子量分析結果見附圖15。
[0101]綜上，與現有技術相比，本發明能直接準確測定融合蛋白含O-糖核心異構體分子量。另外，實施例6或7的實驗結果與實施例1或2的實驗結果進行對比，可以看出，融合蛋白只進行N-糖去除而沒有進行唾液酸去除或者只進行唾液酸去除而沒有進行N-糖去除，融合蛋白在ESI源碎裂時離子化效率將受到較高的抑制，最后只能獲得少數幾個含O-糖核心融合蛋白準確分子量；如利用特異性脫糖酶既去除N-糖，也去除唾液酸，融合蛋白在ESI源碎裂時離子化效率抑制大大降低，最終可獲得絕大多數含O-糖核心融合蛋白準確分子量。另外，實施例3、4或5的實驗結果與實施例1或2的實驗結果進行對比，可以看出，融合蛋白N-糖去除后再進行唾液酸去除時不調節緩沖液pH值，以及唾液酸去除后再進行N-糖去除時不調節緩沖液PH值，融合蛋白在ESI源碎裂時離子化效率也受到了一定的抑制，能獲得主要幾個含O-糖核心融合蛋白準確分子量，但效果不如調節緩沖液pH值的方式，如融合蛋白N-糖去除后再進行唾液酸去除時調節緩沖液pH值4.0?7.0，以及唾液酸去除后再進行N-糖去除時調節緩沖液pH值7.0?8.0，融合蛋白在ESI源碎裂時離子化效率抑制將大大降低，能獲得絕大多數含O-糖核心融合蛋白準確分子量。
【主權項】
1.一種融合蛋白分子量分析方法，其特征在于，所述方法包括步驟: (1)融合蛋白N-糖去除和/或唾液酸去除； (2)對去除N-糖和/或唾液酸的融合蛋白進行分子量分析。2.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)融合蛋白N-糖去除， (2)融合蛋白唾液酸去除， (3)對去除N-糖和唾液酸的融合蛋白進行分子量分析； 其中，上述步驟(I)和(2)順序可以互換。3.根據權利要求2所述方法，其特征在于，融合蛋白N-糖去除時溶液pH值為7.0?8.0。4.根據權利要求2所述方法，其特征在于，融合蛋白唾液酸去除時溶液pH值為4.0?7.0。5.根據權利要求3所述方法，其特征在于，所述融合蛋白N-糖去除通過以下方法實現:取融合蛋白樣品，加入NH4HCO3或I % NH3.H2O調節pH值至7.0?8.0，加入肽N-糖苷酶，混勻后，37°C孵育24小時。6.根據權利要求4所述方法，其特征在于，所述融合蛋白唾液酸去除通過以下方法實現:取融合蛋白樣品，加入NH4HCO3或I %甲酸調節pH值至4.0?7.0，加入唾液酸酶，37°C孵育24小時。7.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述融合蛋白的分子量是通過ES1-Q-TOFMS方法進行分析獲得。8.根據權利要求7所述方法，其特征在于，所述ES1-Q-TOFMS分析包括步驟:將融合蛋白用50mM pH8.0的NH4HCO3溶液稀釋至lmg/mL ;然后脫鹽柱脫鹽；最后進行質譜分析。9.根據權利要求1-8任一所述方法,其特征在于，所述融合蛋白是Etanercept或rhCTLA4-1g。10.根據權利要求3或4所述方法，其特征在于，所述pH值是通過酸性或堿性可揮發性溶液調節。
【專利摘要】本發明公開一種融合蛋白分子量分析方法，具體地，本發明公開一種用ESI-Q-TOF進行復雜糖基化融合蛋白準確分子量分析的方法，具體是一種利用特異性脫糖酶去除融合蛋白N-糖和唾液酸的樣品前處理方法，處理后的融合蛋白經脫鹽柱分離，流出液被ESI源碎裂成連續多電荷離子，經串聯Q-TOF質譜分析、去卷積計算可獲得含O-糖核心異構體的完整蛋白準確分子量。本發明的方法可克服N-糖和/或唾液酸對融合蛋白離子化效率的高度抑制，可準確測定含O-糖融合蛋白完整蛋白分子量。
【IPC分類】G01N33/68
【公開號】CN105628927
【申請號】CN201410625245
【發明人】呂鋒華, 劉周陽, 環民霞, 黃黎明, 譚青喬
【申請人】上海中信國健藥業股份有限公司
【公開日】2016年6月1日
【申請日】2014年11月7日