專利名稱：：Cea陰性結直腸癌檢測和預后判斷的質譜試劑盒和方法
技術領域：
：本發明涉及一種新的結直腸癌生物樣品中蛋白質分析方法的試劑盒。一種通過能與蛋白質結合的基質去捕獲生物標志，并用有定量控制的質譜分析來檢測CEA陰性結直腸癌生物標志。在此提及的此項發明涉及蛋白質檢測領域，為一種新的非侵入性的體外質譜檢測方法。本發明可以應用到已經脫離人體的體液中的CEA陰性結直腸癌生物標志組合的檢測方法或試劑盒。
背景技術：
：隨著人類基因組計劃的實施和完成，科學家們提出了后基因組(post-genome)計劃的概念，研究要點轉移到功能基因組學上，而生物功能主要體現物質是蛋白質。1994年，澳大利亞Macquarie大學的Wilkins和Williams首先提出蛋白質組(proteome)的概念，指的是"一種基因組所表達的全部蛋白質"，即包括一種細胞乃至一種生物所表達的全部蛋白質。對于蛋白質組的研究是功能基因組學研究的核心，稱為蛋白質組學(proteomics)。蛋白質組學被認為是后基因組研究中最主要的部分。與基因組相比，蛋白質組的組成更復雜，功能更活躍，應用前景更廣泛。蛋白質組學從細胞整體水平進行蛋白質屬性的研究，如表達水平、翻譯后修飾及相互作用等，并由此獲得對于疾病過程、細胞生理生化特征和調控網絡的廣泛完整的認識。所以，蛋白質組學技術正在逐步成為生物學、醫學及制藥學等的重要研究手段。不論是細胞的正常功能還是病理特性都在一定程度上取決于細胞所表達的蛋白質功能。因此，鑒定人體內表達的蛋白質的區別，可用于體外疾病樣本診斷及篩査，并最終用于藥物開發和疾病治療。而要進行蛋白質表達和功能的差異化分析，要求能夠達到分辨細胞內分子的復雜混合物的程度。但細胞內許多物質往往以微量存在，目前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用這些常規手段難以進行化學結構及蛋白質序列鑒定分析。用質譜聯合可克服這一技術缺點。結直腸癌的發生是一個多基因突變導致抑癌基因失活、癌基因活化的過程。基因組學研究由于自身的限制難以完全闡明基因與蛋白質參與過程及其具體作用，而近年來蛋白質組學的發展為人們從整體上了解惡性腫瘤的發生、發展提供了較為理想的技術平臺。目前臨床上對惡性腫瘤預后評估主要依賴于臨床表現、病理學及傳統腫瘤標志(tumormarker),但腫瘤早期復發或轉移時常常無明顯臨床表現，而病理學證據很難得到且重復性差。傳統腫瘤標志癌胚抗原(CEA)在結直腸癌預后評估中有重要價值，但臨床工作中也發現有相當比例的結直腸癌患者中因癌胚抗原表達陰性而無法檢測，同時對于癌胚抗原陰性表達的結直腸癌患者的預后評估則缺乏有效的早期監測手段。但是，我們在進行蛋白質質譜分析時發現沒有一個臨床CEA陰性結直腸癌質譜標準化的試劑盒。
發明內容本發明的目的是建立一種在CEA陰性結直腸癌生物樣品中檢測的方法。該方法為CEA陰性結直腸癌的早期檢測提供了新的途徑，并為進一步發現新的CEA陰性結直腸癌生物標志提供了基礎。本發明涉及一種通過生物標志結合的基質表面，并用定量性質譜分析來同時檢測多種生物標志狀態。本發明中的生物標志是利用一臺質譜儀來發現的。該設備的質量精確度約為+/_0.1%。基質是任何能與生物標志選擇性或特異性結合的物質。舉例說明，WCX陰離子，C8/C18疏水作用基質吸附劑，分離生物化學中的這些方法和由這些方法產生的吸附劑具有診斷反面的用途(即陰離子吸附劑捕獲陽離子蛋白質)。底基洗去未吸附的物質。任何適宜的洗液均可使用。生物標志首先能夠被具有能與生物標志物結合基質吸附表面捕獲，非吸附物能從基質上洗脫，吸附到底基的生物標志物在質譜儀中被檢測。生物標志通過離子發生源，如激光，被離子化，產生的離子被一個離子感受集合器收集，然后質量分析器分析那些通過的離子。之后，檢測器將檢測的離子信息轉換為質荷比。定量性控制及質譜激光能量調控每次測試前，用質譜的標準化質控血清，將標準化質控血清中用于定量的標準峰6634.0Da強度調至50%質譜信號強度的最大值。生物標志的檢測明顯地將與信號強度的檢測有關。這樣，生物標志的數量與質量都可以被檢測出來。飛行質譜對待分析物的分析生成飛行時間譜。該飛行時間譜的最終分析并不表示離子化能量攻擊一個樣本產生的單獨的脈沖信號，而是一系列脈沖的信號之和。這樣降低了干擾，并增加了動態范圍。該飛行時間數據受數據處理軟件的影響。軟件中數據處理主要包括轉換飛行時間與質荷比而產生質譜，降低基線而減少儀器的偏移量，和過濾高頻噪音而減輕高頻噪音。通過對生物標志的吸附和檢測而產生的數據可利用計算機的數據分析程序進行分析。該計算機程序分析這些數據以顯示檢測出的生物標志的數量，并顯示信號的強度和確定被檢測的每個生物標志的分子量。數據分析還能包括一系列的確定生物標志的信號強度和矯正數據對預定統計分布狀態的偏離。例如，通過計算與某些參數相關的每個峰值的高度，可規范觀測到的峰。該參數可能是由儀器和類似能量吸收分子等化學成分產生的不重要的干擾，這可以設置調零。計算機可以將計算結果數據轉換成各種形式來表現。其標準譜可以表示，但在一種形式中只有峰高和質量信息可以在譜帶中保留，產生一個較清晰的圖，并使具有幾乎相同分子量的生物標志物更易顯現。在另一種形式中，兩個或更多的譜比較，便于突顯獨特的生物標志物和那些高于或低于校準樣本的生物標志物。分析一般包括展示從待分析物得到的信號的圖譜中峰的鑒定。峰可以通過視圖進行選擇，軟件是可用的，它可自動檢測峰。一般情況下，該軟件通過鑒定信號具有信噪比高于一個選擇閾值并標記出在峰信號的質心處的峰的質量這樣的方式操作。在一個有效的程序中，比較許多譜線以認定出現在質譜中某一選定范圍內同樣的一些峰。該軟件的一個版本聚集所有出現在確定的質量范圍內的各條光譜的峰，對所有在質量(質荷比)中值附近的峰指定一個質量(質荷比)簇。發明中使用的生物標志是基質所捕獲。這些生物標記是進一步通過質譜(massspectrometry)測定其不同分子量來知道它們特定的身份。血清質譜多肽蛋白圖譜的重復性同一樣本同時做8點重復試驗，所有峰值的CV值均<10%，顯示了較好的重復性(圖1)。結直腸癌多肽蛋白檢測篩選用Mann-Whitney〃檢驗比較配對樣本的蛋白峰，通過分析幾百種血清蛋白指紋峰，發現下述蛋白指紋或質譜多肽圖譜可以用于區分正常與結直腸癌。峰值CV〉30")i或者p〈0.05為有顯著性差異結直腸癌患者與健康人群有7種差異多肽蛋白(p〈0.05),其中3398.3Da多肽蛋白低表達，2424.4、2686.9、2821.4、2901.4、5477.1、8453.9土15Da多肽蛋白高表達(表1)。進一步建立癌胚抗原陰性表達結直腸癌的檢驗模型，由3398.3、5477.1、8453.9土15Da3個蛋白峰組成的檢驗模型對60例癌胚抗原陰性表達結直腸癌患者和60例健康人群盲篩檢驗的敏感性100%，特異性83%(圖2、表2);即當3398.3Da小于等于7.83;或當3398.3Da大于7.83且5477.1Da大于1.54且8453.9Da大于1.18時為CEA陰性結直腸癌患者，否則為健康人群(圖3、表l)。結直腸癌轉移相關多肽蛋白篩選將結直腸癌患者按照臟器轉移情況分組，然后進行組間比較，其中4種多肽、蛋白質在臟器轉移組中顯著增高(表3):3622.7、4156.1、5336.2、11683.3土15Da。將結直腸癌患者按淋巴結轉移組情況分組，發現2種多肽、蛋白質在淋巴結轉移組中顯著增高(表4):3622.7、32341.3土15Da。用同一例代表性患者的11683.3Da峰顯示WCX磁珠靈敏性比WCX芯片更高(圖4)。血清CEA測定值與結直腸癌患者多肽蛋白表達差異將結直腸癌患者按照血清CEA《5Pg/L和〉5l^g/L分成2組，進行組間比較，兩組間有顯著性的差異蛋白質峰，其中4種蛋白質在CEA〉5Pg/L組中顯著增高(表5):3489.7、4533.3、9604.9、32341.3土15Da。結直腸癌患者術前術后個體化多肽蛋白表達差異對結直腸癌患者在根治性切除術后14天再次進行檢測，發現質荷比(m/z)分別為3399.3、4117.3、4964.8土15Da的3種多肽蛋白在血清中的濃度顯著降低，接近于健康人群(表6)。根治性切除的患者中顯著下降(3399.3Da術前14.5、術后4.6)基本接近于健康人群(圖5);而非根治性切除的患者中其差異并不明顯(3399.3Da術前12.0、術后8.9)(圖6)。腫瘤的發生是一個多基因突變過程，單一的癌胚抗原檢查有一定的局限性。目前，大約43X的結直腸癌患者由于癌胚抗原表達陰性而不能被早期檢測。癌胚抗原(CEA〉5化/L)在結直腸癌中的陽性檢測率為57%，而由3398.3、5477.1、8453.9土15Da3個差異峰組成的檢測模型對癌胚抗原陰性表達結直腸癌的陽性檢測率為100%。這是首次發明癌胚抗原陰性表達結直腸癌的檢測方法。故用蛋白指紋圖譜技術來檢測腫瘤標志蛋白指紋，特別是對癌胚抗原陰性表達的結直腸癌患者的早期檢測及健康體檢尤有意義。本發明篩選出了幾種能夠在癌胚抗原陰性表達及陽性表達結直腸癌患者血清中檢出的具代表性蛋白質(2424.4、2686.9、2821.4、2901.4、3398.3、5477.1、8453.9土15Da)分子量較小。早期結直腸癌局限于結直腸粘膜組織，腫瘤表達的大分子蛋白不易滲透進入血液，而小分子蛋白則易于進入外周血循環，因此，小分子腫瘤標志的篩選有利于結直腸癌的早期發現。而結直腸癌目前常規腫瘤標志的分子量非常大，如癌胚抗原的分子量為150300kDa，這可能是常規腫瘤標志在早期結直腸癌中敏感性低下的原因。這些在結直腸癌患者與正常人中差異十分顯著的蛋白質可能是早期結直腸癌敏感的腫瘤標志。結直腸癌的預后取決于是否存在轉移，尋找與轉移相關的蛋白質分子，積極進行有效的干預措施可以改變一部分結直腸癌患者的命運。本發明發現3489.7、32341.3土15Da2個多肽蛋白與結直腸癌淋巴結轉移相關，在淋巴結轉移的病例中表達顯著上升；3622.7、4156.1、5336.2、11683.3土15Da的4個多肽蛋白與結直腸癌遠處臟器轉移相關，表達顯著上升，為臨床正確判斷疾病進程提供幫助。用同一結直腸癌遠處臟器轉移病人的11683.3Da蛋白峰顯示WCX磁珠靈敏性比WCX芯片更高，證明磁珠表面的結合面積大于蛋白質芯片，從而其靈敏性比蛋白質芯片更高。對結直腸癌患者術前與術后的對比分析，發現3399.3、4117,3、4964.8t15Da3個多肽蛋白的表達存在顯著性差異。在結直腸癌獲得根治性切除術后顯著下降，基本接近于正常人；而在非根治性切除術的患者中其差異并不明顯。這一結果與胃癌術后現象類似，同時證實了這些多肽蛋白在結直腸癌患者中的敏感性，也為早期檢測結直腸癌術后復發和轉移提供了方向。常用于結直腸癌的常規腫瘤標志如癌胚抗原CEA、糖蛋白類抗原CA19-9和CA72-4等，其敏感性只有20.9%56%，在早期結直腸癌中的敏感性則更低。尋找敏感的、早期可出現的、新的蛋白質標記物是目前的重點。本發明通過對血清CEA測定值《5化/L與〉5Pg/L的結直腸癌患者的對比分析，發現3489.7、4533.3、9604.9、32341.3土15Da的4個多肽、蛋白質存在顯著性差異(P<0.05)，在CEA>5^g/L的病例中表達顯著上升；其中32341.3Da同時又與淋巴結轉移相關，這可能為發明結直腸癌早期而敏感的預后相關生物標志提供了一種思路。本發明利用WCX陰離子基質及利用C8/C18疏水基質磁珠為例對正常人與結直腸癌血清(漿)進行蛋白質對比分析。定量性控制及質譜激光能量調控每次測試前，用質譜的標準化質控血清(漿)，將標準化質控血清(漿)中用于定量的標準峰6634.0Da強度調至50%質譜信號強度的最大值。一種CEA陰性結直腸癌檢測和預后判斷的質譜試劑盒和方法的具體操作歩驟以下是用本發明提供的一個操作方案及CEA陰性結直腸癌檢測試劑盒實例。1.樣品處理及標準化質控血清(漿)制備將生物樣品稀釋在稀釋緩沖溶液中，視需要離心澄清樣品。質譜的標準化質控血清(漿)制備定義符合如下標準供血者10人，5男5女，血型為0型；年齡為18-30歲；民族漢。生化指標正常，包括總膽固醇、甘油三酯、空腹血糖、乙肝表面抗原、肝功檢查、腎功檢查；無遺傳病家族史；無重大傳染病史。女性不能懷孕，男性為不吸煙者。2.基質與CE^陰性結直腸癌、標準化質控血清(漿)制備、樣品上樣抽取0型血的健康受試者(男女各半)的新鮮血液(a)4'C下待血液凝固后馬上離心，4'C離心5min分離血清。(b)4。C下馬上離心，4。C離心5min分離血漿。標準化質控或結直腸癌血清(漿)樣品分裝100pl—小管，于一8(TC儲存；或取混合血清(漿)1:2稀釋于U9緩沖液(9MUrea,2%CHAPS,50rnMTris-HCL，pH9.0)一小管，25。C儲存。即成為結直腸癌、標準化質控血清(漿)試劑盒。將質譜的標準化質控血清及樣品點樣在有支持物的基質中的一個位點上。支持物用磁性珠或芯片。基質是用于標記、結合血清(漿)的。標記至液相色譜柱子上的基質可用液相色譜質譜聯用儀(LC-MS)的標準方法去分析。將質譜的標準化質控O血清(漿)用于質譜儀試劑盒的定量方法。3.洗滌用結合緩沖液洗滌。在樣品完全干燥前將第一份洗滌溶液加到該位點。洗滌溶液在位點上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重復以上步驟。以下步驟用0.05%1%三氟乙酸徹底洗滌整個磁性珠陣列點，將生物標志洗脫至質譜專用金屬片(有3x3mm圓孔)上，自然干燥金屬片，加0.5吸能分子(以50%乙腈，0.5%三氟乙酸制備的飽和標準溶液)。吸能分子可用Sinapinicacid或alpha—Cyano-4—hydroxycirmamicacid等。3.質譜的定量控制及測試用激光解吸/離子化飛行時間質譜儀，用氮激光儀(337ran)和80cm或120cm飛行管分析陣列，或用電噴霧電離已洗脫的生物標志后用液相色譜質譜聯用儀(LC-MS)標準方法去分析滯留于各位點的生物標志或蛋白質。用計算機分析數據進行數據重疊展示。定量性質譜調控每次測試前，用質譜的標準化質控血清(漿)，將標準化質控血清中用于定量的標準峰6634.0Da等強度調至50%信號強度的最大值。定量性控制及質譜激光能量調控每次測試前，用質譜的標準化質控血清(漿)，將標準化質控血清(漿)中用于定量的標準峰6634.0Da強度調至50%質譜信號強度的最大值。用2746i1Da、5909土1Da、6634土1Da標準峰為質譜內標定性(分子量)質控標準。本發明將蛋白質分成了幾大類，即WCX陰離子、C8/C18疏水作用等蛋白。這樣，可用質譜儀直接進行分析及定量。利用C8及C18疏水基質磁珠或芯片的實驗結果與上述WCX陰離子基質磁珠或芯片的實驗結果一致。本發明可用于體外細胞和非侵入性的體外結直腸癌質譜檢測方法的定量控制，如離體體液的結直腸癌試劑盒用于臨床質譜的結直腸癌檢測方法。可以檢測多個結直腸癌蛋白質生物標志群及質譜多肽圖譜。本發明中的試劑盒及方法與其他非侵入性的體外檢測方法比較，具有以下的特點(1)準確質譜直接分析有很強的精確性，一般誤差率只有O.lDa。因為蛋白質是由氨基酸組成的，而氨基酸的平均質量是已知的，如果知道了抗原或生物標志的總分子量，那么抗原的變異(指氨基酸變化)就很容易被推測出來。(2)方便本方法將蛋白質分成了幾大類，即陰離子、疏水作用蛋白。這樣，可用質譜儀直接進行分析。支持基質的方法所用吸附劑的支持物是磁珠或芯片。用磁性分離器分離磁珠及樣品，無需離心樣品。磁珠表面的結合面積大于芯片，從而其靈敏性比芯片更高。這樣，可用質譜儀直接進行分析。(3)快捷用本發明提供的蛋白指紋法進行檢測時，無需對蛋白質進行測序。本發明采用了計算機"條碼格式"，信號強度沿著線性軸以暗度強度值顯示。此強度可以用掃描儀記錄并用分析軟件自動分析對比強弱，從而有助于臨床復雜的檢測，如可用此"蛋白指紋"或條碼格式進行醫學分析。說明書附1血清質譜多肽蛋白圖譜的重復性圖2癌胚抗原陰性表達結直腸癌及健康人群盲篩的敏感性、特異性及ROC曲線圖3癌胚抗原陰性表達結直腸癌(Cancer)、結直腸管狀腺瘤(Control)及健康人群(Normal)的蛋白指紋圖譜圖4結直腸癌轉移相關蛋白(11683.3Da)的芯片與磁珠檢測靈敏性比較圖5—例根治性切除術后患者的蛋白指紋圖譜圖6—例非根治性切除術后患者的蛋白指紋圖譜具體實施方式本發明將結合具體實施例作進一步說明，這些實例僅用于說明目的，而不用于限制本發明范圍。實施例1正常與CEA陰性結直腸癌患者的區分及質譜的試劑盒制備(1)實驗方法60例CEA陰性結直腸癌患者(CEA《5Pg/L)、68例CEA陽性結直腸癌患者(CEA〉5Pg/L)，均為腺癌，平均年齡61.5歲；進展期結直腸癌患者僅20例未見淋巴結轉移，其余均伴淋巴結轉移；伴臟器轉移32例肝轉移16例，肺轉移12例，卵巢轉移4例。由結直腸鏡確診的結直腸良性管狀腺瘤患者15例。健康體檢者60例，平均年齡59.5歲，來源于肝功能、腎功能等檢查均正常的體檢人群。受檢者空腹釆集靜脈血1mL，采集后立即于4。C冰箱靜置2小時，4°C4000r/min離心10分鐘分離血清，將血清于4°C12000r/min再次離心5分鐘，去除所有殘留細胞碎片和不溶物，在冰上將血清分裝為IO(MV管，共5管，保存于-8crc冰箱。避免反復凍融。蛋白質芯片及磁珠操作步驟血清樣品處理從-8(TC冰箱中取出血清，于4"，10OOOrpm離心5min。取IO叱血清樣品，加20叱U9處理液(9mol/L尿素，2%CHAPS,1%DTT,50畫1/LTris-CL,pH9.0),充分混勻，冰浴振蕩30min后取出，加入360^L結合緩沖液(10Ommol/LNaAc，pH4.0),立即混勻。芯片上樣及洗脫將WCX2芯片(弱陰型離子表面，羧基基團，捕獲正電荷基團蛋白)裝入bioprocessor中，每孔加入200A結合緩沖液，室溫振蕩洗滌2次，每次5min,甩千。每孔分別加入處理好的樣品，振蕩孵育lh,甩去樣品，用200ul芯片洗脫緩沖液(10Omraol/LNaAc,pH4.0)室溫振蕩洗滌2次，每次5min,甩干；再用HPLCH20洗滌一次，立即甩干。取出芯片，每點加2次0.5叱SPA飽和溶液，晾干后上機測量。磁珠上樣及洗脫將處理好的樣品IOO叱加至已裝好WCX磁珠(弱陰離子表面，羧酸基團，捕獲正電荷基團蛋白)的PCR管(北京賽爾迪公司)中，置磁性處理器上孵育30min，除去液體。加lO(mL磁珠結合緩沖液(50mmol/LNaAc,pH4.04.3)至已裝好WCX磁珠的PCR管，置磁性處理器上孵育2分鐘，除去液體，重復上述操作2次。加10叱ElutionBuffer2min，洗脫標本至上清液。取5A上清液移至另一個PCR管中，加入5吣SPA飽和溶液充分混勻，取l化混合溶液加樣到Au片上，晾干后上機測量。數據收集將處理好的Au片置入MALDI-TOF-MS進行蛋白質譜分析。在讀取數據前，用加有all-in-one標準蛋白質的芯片校正質譜儀，使分子量誤差<0.1%。本研究中閱讀儀的主要參數設定為，最高檢測分子量為50kDa，優化分子量范圍100015000Da，最佳聚集中心8000Da，數據釆集參數范圍2080，收集總數為130次。軟件中設定讀片程序，以讀取數據。用血清中的內標峰4091.1Da或6634.0Da校正原始數據中的蛋白指紋圖譜，使分子量誤差<0.01%，從而獲得的精確的蛋白指紋圖譜。統計學分析應用軟件分析處理所有峰譜，形成蛋白指紋圖譜。所有的圖譜都進行了標準化，統一到它們自己全部的離子總數(峰面積的總和)。將標準化質控血清中用于定量的標準峰4091.1或6634.,0Da強度調至4050%信號強度的最大值，并且用最顯著的峰進行了校正，而后又進行了"減少基線"，定義蛋白峰(s/n〉5，最小的峰強度〉1.6)。分析所有l50kDa之間的蛋白峰，并且仔細檢査了每個相應的峰，計算出峰的平均數，標準差(SD)和變異系數(CV%)。用Mann-Whitney〃檢驗比較配對樣本的蛋白峰，計算p值.結直腸癌CEA檢測取空腹靜脈血4mL，離心后提取血清，用i2000全自動免疫定量檢測系統(美國，雅培)微粒體發光法測定，按照檢測系統步驟進行操作，正常參考值〈5Pg/L。血清質譜多肽蛋白圖譜的重復性檢驗同一樣本同時做8點重復試驗，所有峰值的CV值均〈10%，顯示了較好的重復性(圖1)。結直腸癌檢測多肽蛋白篩選用Marm-Whitney〃檢驗比較配對樣本的蛋白峰，初步分析篩選出結直腸癌患者與健康人群有7種差異多肽蛋白，其中3398.3Da多肽蛋白低表達，2424.4、2686.9、2821.4、2901.4、5477.1、8453.9+15Da多肽蛋白高表達(表l)。表l篩選結直腸癌患者與健康人群候選多肽蛋白的結果(P〈0.05，3T土sd)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實施例2試劑盒的雙盲測試用從實施例1中篩選出幾個特征蛋白峰，3398.3、5477.1、8453.9土15Da3個差異峰組成的檢驗模型對癌胚抗原陰性表達結直腸癌患者和健康人群盲篩檢驗的敏感性100%，特異性83%(表2);即當3398.3Da小于等于7.83;或當3398.3Da大于7.83且5477.1Da大于1.54且8453.9Da大于1.18時為癌胚抗原陰性表達結直腸癌患者，否則為健康人群(圖3、表1、2)。表2試劑盒的雙盲測試雙盲測試癌胚抗原陰性表達結直腸癌(60)正常(60)癌胚抗原陰性表達結直腸癌6010正常050敏感性100%特異性83%利用C8及C18疏水基質磁珠或芯片的實驗結果與上述WCX陰離子基質磁珠或芯片的實驗結果一致。實施例3結直腸癌轉移相關多肽蛋白篩選將結直腸癌患者按照臟器轉移情況分組，然后進行組間比較，其中4種多肽、蛋白質在臟器轉移組中顯著增高(表3)。將結直腸癌患者按淋巴結轉移組情況分組，發現2種多肽、蛋白質在淋巴結轉移組中顯著增高(表4)。用同一例代表性患者的11683.3Da峰顯示WCX磁珠靈敏性比WCX芯片更高(圖4)。表3結直腸癌臟器轉移組及非臟器轉移組的多肽蛋白豐度差異(P〈0.05,3f士sd)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表4結直腸癌淋巴結轉移組及非淋巴結轉移組的多肽蛋白豐度差異(P〈0.05,r士sd)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實施例4血清CEA測定值與結直腸癌患者多肽蛋白表達差異將結直腸癌患者按照血清CEA《5^/L和〉5^/L分成2組，進行組間比較，兩組間有顯著性的差異蛋白質峰，其中4種蛋白質在CEA〉5Pg/L組中顯著增高(表5)。表5結直腸癌血清CEA《5l^g/L和〉5^g/L兩組的多肽蛋白豐度差異(P〈0.05,3T±sd)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實施例5結直腸癌患者術前術后個體化多肽蛋白表達差異對結直腸癌患者在根治性切除術后14天再次進行檢測，發現質荷比(m/z)分別為3399.3、4117.3、4964.8Da的3種多肽蛋白在血清中的濃度顯著降低，接近于健康人群(表6)。根治性切除的患者中顯著下降(3399.3Da術前14.5、術后4.6)基本接近于健康人群(圖5);而非根治性切除的患者中其差異并不明顯(3399.3Da術前12.0、術后8.9)(圖6)。表6結直腸癌根治性切除術前、術后血清多肽蛋白豐度差異(P<0.05,3T士sd)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。權利要求1.一種用磁珠支持基質的方法捕獲生物樣品中CEA陰性結直腸癌蛋白質組的試劑盒和方法，其特征是采用蛋白指紋法對CEA陰性結直腸癌中蛋白質組或質譜多肽圖譜進行鑒別檢測。用標準化質控血清(漿)控制下的定量性質譜分析來檢測。該方法通過以下步驟實現(1)樣品處理及質譜標準化質控血清(漿)制備；(2)基質與血清(漿)結合試劑盒制備、樣品上樣；(3)洗滌；(4)質譜的定量控制及質譜檢測；其中所述步驟(1)將生物樣品稀釋在稀釋緩沖溶液中。用O型血，男女相等，混合制備質譜的標準化質控血清(漿)；所述步驟(2)將質譜的標準化質控血清(漿)及樣品點樣在有支持物的基質中的一個位點上。支持物用磁珠或芯片。基質是用WCX陰離子基質及C8/C18疏水基質與血清(漿)選擇性結合；所述步驟(3)用結合緩沖液洗滌。在樣品完全干燥前將第一份洗滌溶液加到該位點。洗滌溶液在位點上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重復以上步驟。用三氟乙酸徹底洗滌整個陣列點，將生物標志洗脫至質譜專用金屬片或位點上。所述步驟(4)加0.5μL吸能分子(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸的制備的飽和標準溶液)用質譜儀去分析滯留與各位點的生物標志或用電噴霧電離已洗脫的生物標志后用質譜儀去分析。對血液進行蛋白質對比分析，用計算機分析血液中質荷比數據。本試劑盒依據幾個特征蛋白峰3398.3、5477.1、8453.9±15Da，雙盲測試CEA陰性結直腸癌的敏感性100％，特異性83％。結直腸癌轉移相關的蛋白峰為3622.7、4156.1、5336.2、11683.3、3489.7、32341.3±15Da；結直腸癌個體化手術療效判斷的蛋白峰為3399.3、4117.3、4964.8±15Da。2.權利要求l所述的蛋白質分析方法，所用的基質包括陰離子、疏水作用吸附劑。3.權利要求2中所用吸附劑的支持物是磁珠或芯片。4.一種權利要求l所述的檢測試劑盒，其特征在于，它包括一容器以及裝于容器中的權利要求1所述的生物樣品。將生物樣品分裝100ul—小管，于一80°C儲存或取生物樣品1:2稀釋于一小管U9緩沖液(9MUrea，2%CHAPS，50rnMTris-HCL，pH9.0)，25°C儲存。5.如權利要求4所述的試劑盒，其特征于，所述的生物樣品為血清或血漿c全文摘要本發明涉及一種用磁珠支持基質的方法捕獲生物樣品中結直腸癌蛋白質組，用磁性分離器分離磁珠及樣品，無需離心樣品。然后用質譜法進行分析的蛋白指紋法。本發明的方法可用于正常人與CEA陰性結直腸癌檢測和預后判斷的蛋白指紋或質譜多肽圖譜的試劑盒。本方法準確、方便且快捷。文檔編號G01N30/02GK101241139SQ20071000340公開日2008年8月13日申請日期2007年2月5日優先權日2007年2月5日發明者洋許申請人:洋許