聯苯菊酯的快速金標試紙條及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種聯苯菊酯的快速金標試紙條及其制備方法，屬于農藥殘留免疫分析技術領域。
【背景技術】
[0002]聯苯菊酯(bifenthrin)又名天王星、蟲螨靈、畢芬寧，是由FMC公司研制開發的一種擬除蟲菊酯類殺蟲、殺螨劑，除對鱗翅目幼蟲、蚜蟲、粉虱、植食性葉螨等20多種農業害蟲有較好防效外，還對衛生害蟲白蟻有強烈的驅避及毒殺作用。聯苯菊酯對魚類及家蠶高毒，對蜜蜂中毒，但該藥在水中溶解度很低(I mg/L)，且能較好的吸附于土壤顆粒表面，因此對環境造成的危害較小。聯苯菊酯具有作用迅速、殘效期長、在土壤中不移動等優點，作為一種理想的白蟻防治毒土處理藥劑，被廣泛應用于我國新建房屋的白蟻預防。
[0003]目前，對農藥殘留的檢測方法主要是儀器分析方法和酶聯免疫分析方法(ELISA)等。儀器分析方法包括高效液相色譜法(High performance liquid chromatography ,HPLC)、氣相色譜法(Gas chromatography，GC)、薄層色譜法(Thin layer chromatography,TLC)、液-質串聯法(HPLC-MS)和氣-質串聯法(GC-MS)等，這些儀器分析方法雖然可以達到較高的檢測靈敏度，但需要復雜昂貴的儀器設備及專業操作人員，加之樣品前處理繁瑣費時、檢測費用高，難以滿足快速、在線檢測的需要。ELISA(Enzyme Linked ImmunosorbentAssay)方法是常用的免疫檢測方法，但是其卻有操作步驟相對較多，檢測時間較長，檢測結果不夠直觀，不能在線進行檢測等缺陷。因而ELISA在聯苯菊酯的現場快速檢測及施藥量控制上的應用受到很大的限制。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是克服現有技術中存在的不足，提供一種聯苯菊酯的快速金標試紙條及其制備方法，該金標試紙條具有特異、敏感、快速、簡便的優點。
[0005]按照本發明提供的技術方案，所述聯苯菊酯的快速金標試紙條，包括襯板，其特征是:在所述襯板上依次排列樣品墊、金標結合墊、纖維素膜和吸水墊，金標結合墊內吸附聯苯菊酯金標抗體，纖維素膜上設有隱形檢測線和隱形對照線，隱形檢測線采用聯苯菊酯半抗原偶聯的載體蛋白溶液印制，隱形對照線采用兔抗鼠IgG抗體印制。
[0006]進一步的，所述聯苯菊酯半抗原偶聯的載體蛋白溶液采用的載體蛋白為牛血清白蛋白BSA、雞卵清白蛋白OVA或人血清白蛋白HAS。
[0007]進一步的，在所述樣品墊外部包裹樣品浸入端保護膜，在吸水墊外部包裹手柄端保護膜。
[0008]進一步的，在所述樣品浸入端保護膜上設有標識線。
[0009]進一步的，所述標識線位于偏向樣品墊一側約0.5厘米處。
[0010]進一步的，所述隱形檢測線靠近樣品墊一側設置，隱形對照線靠近吸水墊一側設置。
[0011]進一步的，述聯苯菊酯金標抗體為膠體金標記的聯苯菊酯單克隆抗體，該單克隆抗體由保藏編號為CCTCC N0.C2014135的雜交瘤細胞株所分泌。
[0012]所述聯苯菊酯的快速金標試紙條的制備方法，其特征是，包括以下步驟:
(1)聯苯菊酯半抗原的合成；
(2)聯苯菊酯半抗原與載體蛋白偶聯得到聯苯菊酯半抗原偶聯的載體蛋白溶液；
(3)聯苯菊酯金標抗體的制備；
(4)金標結合墊的制備；
(5)兔抗鼠IgG抗體的制備；
(6)聯苯菊酯半抗原偶聯的載體蛋白溶液和兔抗鼠IgG抗體包被纖維素膜；
(7)試紙條的組裝。
[0013]進一步的，所述步驟(4)金標結合墊的制備:將載體蛋白溶液以8μ?/cm的量噴在金標結合墊上，42 °C干燥50 min后，再把金標記抗體以7 μ?/cm的量噴在金標結合墊上，干燥箱42 °C干燥50 min，真空干燥保存。
[0014]進一步的，所述步驟(6)具體為:把聯苯菊酯半抗原偶聯的載體蛋白溶液以1.2 μ1/cm的量噴在纖維素膜的下側，作為檢測線;把兔抗鼠IgG以1.2 μ?/cm的量噴在纖維素膜的上側，作為對照線。
[0015]本發明具備以下優點:
(I)特異性強，敏感性高:本發明所述金標試紙條以膠體金標記高親和力的單克隆抗體為基礎制備而成，金標抗體中的膠體金顆粒與抗體分子之間無共價鍵，兩者通過異性電荷間的范德華力相結合，膠體金的標記對單克隆抗體的特異性和親和力影響很小，而且有較高的標記率。因此，試紙條很好的保留了單克隆抗體的特性，具有較強的特異性和較高的敏感性，檢出最低限量為7.5 mg/L O
[0016](2)簡便、快速:在使用本發明所述金標試紙條時，無需任何其他輔助儀器，可現場操作，只要將檢測樣加入樣品墊，在5至10分鐘內即可判定檢測結果。
[0017](3)結果顯示形象、直觀、準確:本發明所述金標試紙條的檢測結果以纖維素膜上的顯色情況來判斷。如果樣品中有待測物時，待測物和金標抗體結合形成抗原一金標抗體復合物，并且繼續上移，遇隱形檢測線不顯色或者顯色很弱即表示檢測樣品陽性或者弱陽性;如果樣品中沒有待測樣品時，金標抗體繼續上移，遇隱形檢測線顯示一條清晰紅線即表示檢測樣品陰性。隱形對照線顏色的有或無表示此試紙條的有效或無效。結果判定形象、直觀、準確、簡單明了。
[0018](4)節省費用，適用范圍廣，便于推廣:使用本發明所述金標試紙條進行檢測，比使用儀器和ELISA試劑盒檢測進行檢測的費用大幅降低。再者，試紙條的使用范圍廣，可滿足不同層次人員的需要，便于推廣應用，具有廣闊的市場前景和明顯的經濟和社會效益。
[0019](5)本發明所述的聯苯菊酯膠體金試紙條，無需專業操作人員及任何輔助類儀器，根據反應所顯現的條帶幾分鐘內即可判定結果，不僅操作簡便、快速、結果直觀準確、成本低，并且可以在室外進行檢測。
【附圖說明】
[0020]圖1為本發明所述聯苯菊酯的快速金標試紙條的示意圖。[0021 ]圖2為本發明所述聯苯菊酯的快速金標試紙條的剖視圖。
[0022]圖3A?圖3E為聯苯菊酯快速檢測試紙條結果判定示意圖，其中:
圖3A為陰性樣品檢測結果，圖3B為弱陽性樣品檢測結果，圖3C為強陽性樣品檢測結果，圖3D和圖3E為試紙條失效。
【具體實施方式】
[0023]下面結合具體附圖對本發明作進一步說明。
[0024]如圖1?圖2所示:本發明所述聯苯菊酯的快速金標試紙條包括襯板1、樣品墊2、金標結合墊3、纖維素膜4、隱形檢測線5、隱形對照線6、吸水墊7、樣品浸入端保護膜8-1、手柄端保護膜8-2、標識線9等。
[0025]實施例1:
一種聯苯菊酯膠體金快速檢測試紙條，所述試紙條含有襯板I和依次排列在襯板上的樣品墊2、金標結合墊3、纖維素膜4和吸水墊7，所述襯板I為不吸水的韌性材料，所述的韌性材料用硬質塑膠條制成，所述金標結合墊3內吸附有聯苯菊酯金標抗體，所述纖維素膜4上有隱形檢測線5和隱形對照線6，所述隱形檢測線5用聯苯菊酯半抗原偶聯的載體蛋白溶液印制，所述隱形對照線6用兔抗鼠IgG抗體印制。所述吸水墊7為吸水能力較強的吸水濾紙或濾油紙。聯苯菊酯金標抗體為膠體金標記的聯苯菊酯單克隆抗體。偶聯聯苯菊酯半抗原的載體蛋白為牛血清白蛋白BSA。在試紙條的吸水墊上設有手柄端保護膜8-2，在樣品墊2上設有樣品浸入端保護膜8-1。所述的保護膜為不透明的膠膜，樣品墊2、金標結合墊3對應的保護膜上印制有待測樣品標記線，該標記線偏向樣品墊一側約0.5厘米處。
[0026]樣品墊2用玻璃纖維棉制成。纖維素膜為硝酸纖維素膜。
[0027]實施例2:
與實施例1基本一樣，區別在于，所述的韌性材料用不吸水硬紙條制成，所述吸水墊7為吸水能力較強的濾油紙。偶聯聯苯菊酯半抗原的載體蛋白為雞卵清白蛋白0VA。樣品墊2用尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜和聚酯膜制成。纖維素膜為純纖維素膜。
[0028]實施例3:
與實施例1基本一樣，區別在于，所述的韌性材料用硬質塑膠條制成，吸水墊7為吸水能力較強的吸水濾紙。偶聯聯苯菊酯半抗原的載體蛋白為人血清白蛋白HAS。樣品墊2用聚偏二氟乙烯膜和聚酯膜制成。纖維素膜為羧化纖維素膜。
[0029]實施例4:一種聯苯菊酯的快速金標試紙條的制備方法，包括以下步驟:
(I)、聯苯菊酯半抗原的合成:
①聯苯菊酯半抗原LBc的合成:稱取0.99 g(5 mmol)聯苯醇于50 mL圓底燒瓶中，加入10 mL無水卩比啶和1.0 g(10 mmol) 丁二酸酐，50°C避光條件下，磁力攪拌反應12 h;向反應溶液中加入10 mL 3.6%&%)鹽酸，繼續反應0.5 h;轉移反應溶液至250 mL分液漏斗，乙酸乙酯萃取兩次(20 mLX2)，水洗兩次(15 mL X 2)，飽和NaCl水溶液洗一次(10 mL);有機相經無水硫酸鈉干燥后，減壓蒸發濃縮近干，重結晶，得到白色固體。
[°03°] ②聯苯菊酯半抗原LBy的合成:取1.4g聯苯醉于100 mL三口燒瓶中，加入0.98g18-冠醚-6，加入20 mL丙酮溶解，冷卻，在冰浴條件下，將2.Sg高錳酸鉀研細后的粉末分批加入，攪拌反應5h;將反應后的混合物抽濾，并用少量丙酮洗濾餅，濾餅風干后，放入研缽內，加入適量的飽和NaHCO3，研磨，使可溶性部分充分溶解，過濾除去MnO2，濾液用濃鹽酸調節pH值為2.0左右，乙醚提取，水洗，無水Na2SO4干燥，濃縮近干;采用柱層析法純化，分別用抓仿:石油醚(20:80)、氯仿進行梯度淋洗，收集氯仿部分，濃縮后得到白色晶體。
[0031](2)、聯苯菊酯半抗原與載體蛋白偶聯:
利用活潑酯法(Active Ester method，簡稱AE法)將具有羧基末端(-C00H)的半抗原偶聯到大分子的蛋白質上。分別稱取0.1 mmol半抗原與0.1 mmol NHS，用600 μ? DMF溶解于反應裝置中；稱取0.1 mmol DCC，用400 μ? DMF溶解;將DCC/DMF溶液緩慢滴加到上述反應裝置中；在磁力攪拌下室溫密封反應7小時；反應終液置4 °(:冰箱冷卻2小時以上，經8000rpm離心5分鐘，取上清活潑酯液緩慢地加入到5 ml 15 mg/ml的BSA蛋白中，反應在磁力攪拌下室溫攪拌4小時；待反應完成后，將反應液置于透析袋內，于0.02 mo I/L pH6.8的PB緩沖液中4 °(:攪拌透析，每四小時換一次透析液，共透析60小時;透析結束后將透析袋中的液體取出，經4 0C12000 rpm離心5分鐘，取上清分裝保存于-20 °(:冰箱中。
[0032]同上述方法，用OVA或HAS代替B