一種蛋白質單分子水平安培免疫分析方法
【專利摘要】一種蛋白質單分子水平安培免疫分析方法，包括以下步驟：①以納米金標記的免疫電極為工作電極，在工作電極上以納米金標記物為中心，進行金標銀染和原電池置換反應，通過銀染層和金鹽的原電池置換反應，選擇性地放大納米金標記物的尺寸，可顯著增大銀染量和放大金屬標記物電化學分析信號；②將這種多重放大的方法用于電化學免疫分析，用原位陽極溶出伏安法獲得該工作電極上所富集到的金屬層的陽極溶出電流信號，從而間接實現樣品中目標分析物的定量分析，使得電化學方法可以檢測低至單分子水平的蛋白質。本發明可用于基于生物親和、金屬標記和陽極溶出伏安法的單目標分析物檢測與多目標分析物多通道檢測。
【專利說明】一種蛋白質單分子水平安培免疫分析方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種蛋白質單分子水平安培免疫分析方法，尤其是涉及一種基于金屬標記和信號多重放大的蛋白質單分子水平安培免疫分析方法。

【背景技術】
[0002]基于各種生物親和反應的生物分析已經吸引了學術界和產業界的極大關注[Satori, C.P.; Henderson, Μ.Μ.; Krautkramer, E.A.; Kostal, V.; Distefano, Μ.Μ.; Arriaga, Ε.A.Chem.Rev.2013, 113, 2733]。從本質上講，生物親和有高的特異性，因此生物分析對其分析物有很高的特異性和選擇性。所以，提高基于生物親和的生物分析方法的檢測靈敏度，是生物分析領域的重點研究內容，也是基于疾病標志物檢測的重大疾病早期預警、食品藥品安全、環境分析等方面急需解決的問題[Song, Y.J.; Zhang, Y.Q.; Bernard, P.E.; Reuben, J.M.; Uenoj N.T.; Arlinghausj R.B.; Zuj Y.L ;Qin, L.D.Nat.Conmiun.2012, 3, 1283]。同時，發展單分子水平的定量分析檢測方法，長期以來一直是廣受關注的分析化學學科重點研究方向[Weiss，S.Science 1999，283，1676.]。大多數情況下，很難直接從生物親和反應本身去獲得很大的生物分析信號，所以經常采用合適的生物標記方法來放大和輸出分析信號[Zhang，L.B.; Zhu, J.B.; Guo, S.J.; Li, T.; Li, J.; Wang, Ε.K.J.Am.Chem.Soc.2013, 135, 2403]。迄今為止，生物分析法中的標記方法通常可分為兩大類，分子標記(如放射性標記和酶標記)法和納米材料標記法。納米材料標記法中，通常采用納米金(AuNPs)、納米銀(AgNPs)、金屬硫化物/硒化物/碲化物量子點(QDs)、碳納米管和石墨烯等納米材料進行標記。
[0003]在材料、環境、能源等眾多學科領域的基礎研究和應用開發中，欠活潑金屬的鹽類(氧化劑)和較活潑金屬(還原劑)之間的原電池置換反應(GRR)技術已得到了廣泛應用。例如，GRR技術已用于研制結構可控和性能增強的各種金屬材料(如Au、Pt、Pd),包括制備具有特殊形狀的納米材料用于生物標記[Sun, Y.; Xia, Y.Science2002, 298,2176.]。另外,金標銀染技術已廣泛用于金納米顆粒(AuNPs)標記的生物親和型分析傳感，能可靠放大生物分析的信號，因為常用的氫醌化學還原Ag+的銀染現象，只能選擇性地發生在催化性的金納米顆粒(AuNP)表面[Taton, T.A.; Mirkin, C.A.; Letsinger, R.L.Science2QQQ, 289, 1757.]。
[0004]申請號為201310459224.4的中國發明專利申請，公開了 “一種基于金屬標記和生物親和的原位陽極溶出伏安分析方法”，雖然使得檢測下限得到有效的降低，但是靈敏度還不夠高，不能達到單分子水平的檢測下限。


【發明內容】

[0005]本發明要解決的技術問題是，克服現有技術的不足，結合金標銀染與GRR法，提供一種蛋白質單分子水平安培免疫分析方法。該方法可以多次地對金納米標記物進行放大，并轉換成為可測電化學信號，再利用申請號為201310459224.4發明專利申請中的原位陽極溶出伏安分析，對樣品中的目標分析物(如蛋白質)進行定量分析。該方法通用性好，操作簡便，使得檢測下限可以低至單分子水平〔檢測下限能達到檢測5個人免疫球蛋白G(hlgG)和人甲胎蛋白(MFP)〕。
[0006]本發明解決其技術問題采用的技術方案是，一種蛋白質單分子水平安培免疫分析方法，包括以下步驟:
①以免疫電極為工作電極，在工作電極上以納米金標記物為中心，進行金標銀染[參見Taton, T.A.; Mirkin, C.A.; Letsinger, R.L.Science2QQQ, 289, 1757.]和原電池置換反應[參見Sun, Y.; Xia, Y.Science2002, 298, 2176.]的多次反應(優選I?10次)，通過銀染層和金鹽的原電池置換反應，選擇性地放大納米金標記物的尺寸(在納米金上銀染后，納米金表面生成大量的銀單質，使得納米金得到放大，在銀染層上再進行原電池置換反應，則在納米金的表面生成又生成了金單質，使得納米金又一次得到放大)，可顯著增大銀染量和放大金屬標記物電化學分析信號；
②將這種多重放大的方法用于電化學免疫分析，用原位陽極溶出伏安法獲得該工作電極上所富集到的金屬層的陽極溶出電流信號，從而間接實現樣品中目標分析物的定量分析，使得電化學方法可以檢測低至單分子水平的蛋白質。
[0007]進一步，所述金鹽為能置換銀染層的金鹽溶液；所述金鹽為I UL?10 mL(濃度不同則體積不同)體積的能置換銀染層的金鹽溶液。(金鹽足量，銀反應完則反應即停止)
進一步，所述金鹽的濃度為I mmol/L稀溶液?飽和溶液。
[0008]進一步，所述金鹽為氯金酸、氯金酸鉀、氯金酸鈉、亞硫酸金鈉或者亞硫酸金鉀。
[0009]進一步，所述金鹽的濃度范圍為I umol/L?0.1 mol/L ;置換銀納米粒子的氯金酸濃度優選5 mmol/L。
[0010]進一步，所述納米金標記物的生物復合物的制備步驟為:將金納米粒子與生物配體結合，形成生物復合物，所述生物復合物對樣品中目標分析物具有生物親和性。
[0011]進一步，所述生物配體為抗原或抗體，或蛋白質。例如，可以將金納米粒子與抗體或抗原結合，形成生物復合物；再將待測的抗體或抗原與該生物復合物結合，形成免疫電極。
[0012]進一步，所述空氣中預先施加的能夠實現金屬標記物的金屬離子電沉積的陰極電位(申請號為201310459224.4，發明專利申請中)為足夠實現擴散控制的金屬電沉積的陰極電位；所述足夠實現擴散控制的金屬電沉積的陰極電位為1.0 V (vs.SCE)?-2.0 V (vs.SCE) ;“V vs.SCE”意為相對于飽和甘汞電極的電位(伏特)。
[0013]進一步，使用陽極溶出伏安法對金屬離子進行定量分析時，采用I組，2組或2組以上電極，每組電極之間形成一個測量通道；每組電極為兩電極或三電極體系。
[0014]進一步，所述目標分析物可為蛋白質。
[0015]所述欠活潑金屬的鹽類(氧化劑)和較活潑金屬(還原劑)之間的原電池置換反應技術用于金標銀染后的銀染層反應。
[0016]本發明的有益效果:(1)金標銀染技術用于金納米顆粒標記的生物親和型分析傳感，能可靠放大生物分析的信號，因為常用的氫醌化學還原銀離子的銀染現象，只能選擇性地發生在有催化活性的金納米顆粒表面，通過銀染層和金鹽的原電池置換反應，選擇性地放大金納米顆粒標記物的尺寸，可顯著增大銀染量和放大金屬標記物的安培免疫分析信號；(2)在金鹽的原電池置換反應后在金納米顆粒上又生成了納米金顆粒，進一步可以進行更大量的金標銀染，多次重復兩種反應來最大程度地放大生物分析的信號，可實現蛋白質單分子水平的安培免疫分析。
[0017]本發明是一種基于免疫親和、金標銀染、原電池置換反應和陽極溶出伏安分析法對樣品中蛋白質目標分析物進行定量分析的方法，并且是在單分子水平檢測目標分析物的電化學分析方法。本發明結合金標銀染與原電池置換反應(GRR)用于生物親和型超敏分析傳感，通過GRR方法和金標銀染對金屬標記物進行多重放大，進行電化學檢測，使得靈敏度顯著提高，檢測下限可降低至單分子水平。
[0018]經實驗證明，本發明與原申請的發明專利“基于金屬標記和生物親和的原位陽極溶出伏安分析方法”(申請號:201310459224.4)相比，本發明基于金屬標記物和信號多重放大的電化學免疫分析響應信號增大了至少5倍，可以檢測到單分子水平的蛋白質。對人免疫球蛋白(hlgG)和甲胎蛋白(hAFP)的分析檢測實驗表明，本發明具有跨至少9個數量級的寬線性范圍，檢測下限低至單分子水平(檢測下限能達到檢測5個人免疫球蛋白G (hlgG)和人甲胎蛋白(hAFP))，顯著優于文獻報道值(現有同類技術的檢測跨度8個數量級，不能進行單分子水平檢測)。本發明用于實際樣品檢測亦獲滿意結果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為本發明方法的實驗步驟示意圖；
圖2 (A)為本發明實施例1中常規制備方法在金納米顆粒(AuNPs)標記的hlgG免疫電極上，采用差分脈沖陽極溶出伏安法檢測標準樣品的原圖；
圖2 (B)為實施例1中常規制備方法在金納米顆粒(AuNPs)標記的hlgG免疫電極上檢測得到的標準曲線圖；
圖2 (C)為實施例1中本發明方法在AuNPs標記的hlgG免疫電極上，采用差分脈沖陽極溶出伏安法檢測標準樣品的原圖；
圖2 (D)為實施例1中本發明方法在AuNPs標記的hlgG免疫電極上檢測得到的標準曲線圖；
圖3 (A)為實施例2中常規制備方法采用AuNPs標記的甲胎蛋白(hAFP)免疫電極上檢測標準樣品的原圖；
圖3 (B)為實施例2中常規制備方法采用AuNPs標記的甲胎蛋白(hAFP)免疫電極上檢測標準曲線圖；
圖3 (C)為實施例2中本發明方法采用AuNPs標記的甲胎蛋白(hAFP)免疫電極上檢測標準樣品的原圖；
圖3 (D)為實施例2中本發明方法采用AuNPs標記的甲胎蛋白(hAFP)免疫電極上檢測標準曲線圖。

【具體實施方式】
[0020]以下結合實施例對本發明作進一步詳細說明。
[0021]參考例I
以下為實施例1使用的hlgG免疫電極和納米材料按照以下方法制備: 實施例1使用的金納米粒子(AuNPs)標記的二抗、免疫電極按照下述方法制備:
(1)AuNPs標記的二抗的制備(Ab2-AuNPs):在100mL沸水中，劇烈攪拌下，加入250 mL4% (質量濃度)的HAuCl4，再逐滴滴加1% (質量濃度)的檸檬酸鈉2.5 mL,當溶液變成酒紅色后，再加熱15 min ;停止加熱后,攪拌冷卻至室溫；在I mL的金膠中加入30 Ug的二抗(Ab2),吸附過夜；4800 rpm低速離心30 min后,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗兩次；最后，結合物再次分散在含有1%牛血清白蛋白(BSA)的I mL 0.1 mol/L PBS中，增加免疫金膠的穩定性，減小分析中的非特異性吸附；未使用時，制備的Ab2-AuNPs保存于冰箱(4 0C)中；
(2)免疫電極的制備:玻碳電極(GCE)先后在0.5微米(um)和0.05 um的氧化鋁懸濁液中打磨拋光處理，再用超純水充分地沖洗電極表面(將電極表面的氧化鋁粉沖洗干凈)，接下來分別在超純水、乙醇、超純水中各超聲5 min以除去電極表面殘留的氧化鋁粉末；然后，在電極表面滴加濃H2SO4 (濃H2SO4的濃度是18.4 mol/L)洗液并保持15s，用超純水沖洗；最后用電化學清洗以徹底除去污染物；電化學清洗步驟為:在10 mL 0.50 mol/L H2SO4中以-1.0 V到1.0 V以0.1 V/s的掃速循環伏安掃描至穩定；處理好的玻碳電極用5(Γ500mL超純水沖洗(將電極表面殘留的H2SO4沖洗干凈)，然后用氮氣吹干用于電沉積Auplate ；
通過雙電位階躍法將Auplate沉積到處理好的玻碳電極上，即在含有2.0 mmol/L HAuCl4的0.50 mol/L H2SO4中，從1.1 V至O V脈沖電鍍180 s (Auplate/GCE)即可；將電極洗凈，氮氣吹干，迅速將6.0 μ L含有1.0 mg/mL 一抗(Ab1)的PBS溶液滴至Auplate/GCE電極上，冰箱(4 °C)保存、過夜，以保證抗體在電極表面的飽和吸附，得到Abi/AiVw/GCE修飾電極；將Ab1AuplateAiCE修飾電極依次用PBS溶液清洗、吹干后，將6.0 uL含有3wt% BSA的PBS溶液滴至電極上，4 °C保持I h以封閉非特異性吸附位點，得到BSA/Abi/AiyM/GCE修飾電極；未使用時，電極保存在4 0C的PBS中。
[0022]將制備好的BSAAb1AuplateAiCE修飾電極，滴加6.0 uL含有不同濃度抗原(hlgG,人免疫球蛋白G)的PBS，在37°C下溫育I h，然后用PBS溶液清洗電極表面，得到hlgG/BSA/Ab1AuplateZGCE修飾電極，該修飾電極上再滴加6 mL含Ab2-AuNPs的PBS溶液(Ab2-AuNPs質量濃度 0.5 mg/mL)于 37°C下溫育 40 min,得到 At^-AuNPs/hlgG/BSA/AbyAUp^te/GCE 電極(Abp Ab2為羊抗人免疫球蛋白G)；
免疫電極的金標銀染步驟如下AbfAuNPs/hlgG/BSA/Abi/Aumte/GCE電極用PBS溶液充分清洗，以除去非特異性吸附的二抗，待干后，滴加6.0 uL的銀增強溶液〔組分:1.0 g對苯二酚，35 mg 硝酸銀，50 mL pH 3.5 檸檬酸緩沖液(0.243 mol/L C6H8O7XH2CH0.163mol/L Na3C6H5O7X 2H20)和50 mL去離子水〕，暗反應30 min,用超純水洗凈,得到silver/Ab^AuNPs/hlgG/BSA/Abi/AUp^^/GCE 電極。
[0023]參考例2
實施例2使用的Au NPs標記的甲胎蛋白(hAFP)免疫電極按照以下方法制備:
(I)AuNPs標記的二抗的制備(Ab2-AuNPs):在100 mL沸水中，劇烈攪拌下，加入250 uL4% (質量濃度)的HAuCl4，再逐滴滴加1% (質量濃度)的檸檬酸鈉2.5 mL,當溶液變成酒紅色后，再加熱15 min ;停止加熱后,攪拌冷卻至室溫；在I mL的金膠中加入30 Ug的二抗(Ab2),吸附過夜；4800rpm低速離心30 min后,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗兩次；最后，結合物再次分散在含有1%牛血清白蛋白(BSA)的I mL 0.1 mol/L PBS中，增加免疫金膠的穩定性，減小分析中的非特異性吸附；未使用時，制備的Ab2-AuNPs保存于冰箱(4 0C)中； (2)免疫電極的制備:玻碳電極(GCE)先后在0.5 11111和0.05 um的氧化鋁懸濁液中打磨拋光處理，再用超純水充分地沖洗電極表面(將電極表面的氧化鋁粉沖洗干凈)，接下來分別在超純水、乙醇、超純水中各超聲5 min以除去電極表面殘留的氧化鋁粉末；然后，在電極表面滴加濃H2SO4 (濃H2SO4的濃度是18.4 mol/L)洗液并保持15s，用超純水沖洗；最后用電化學清洗以徹底除去污染物；電化學清洗步驟為:在10 mL 0.50 mol/L H2SO4中以-1.0 V到1.0 V以0.1 V/s的掃速循環伏安掃描至穩定；處理好的玻碳電極用5(Γ500mL水沖洗(將電極表面殘留的H2SO4沖洗干凈)，然后用氮氣吹干用于電沉積Auplate ；
通過雙電位階躍法將Auplate沉積到處理好的玻碳電極上，即在含有2.0 mmol/L HAuCl4的0.50 mol/L H2SO4中，從1.1 V至O V脈沖電鍍180 s (Auplate/GCE)即可；將電極洗凈，氮氣吹干，迅速將6.0uL含有1.0 mg/mL 一抗(Ab1)的PBS溶液滴至Auplate/GCE電極上，冰箱(4 °C)保存、過夜，以保證抗體在電極表面的飽和吸附，得到Abi/AiVw/GCE修飾電極；將Ab1AuplateZGCE修飾電極依次用PBS溶液清洗、吹干后，將6.0 μ L含有3wt% BSA的PBS溶液滴至電極上，4°C保持I h以封閉非特異性吸附位點，得到BSA/Abi/AiyM/GCE修飾電極；未使用時，電極保存在4 0C的PBS中；
將制備好的BSA/Abi/AiVM/GCE修飾電極，滴加6.0 uL含有不同濃度抗原(hAFP，人甲胎蛋白)的PBS，在37°C下溫育I h，然后用PBS溶液清洗電極表面，得到hAFP/BSA/Ab/Auplate/GCE修飾電極，該修飾電極上再滴加6 mL含Ab2-AuNPs的PBS溶液(Ab2-AuNPs質量濃度是0.5 mg/mL)于 37 °C下溫育40 min,得到 At^-AuNPs/hAFP/BSA/Abi/AUp^te/GCE 電極。(此實施例中Ab1、Ab2為鼠抗人甲胎蛋白)。
[0024]免疫電極的金標銀染步驟如下:除用甲胎蛋白(hAFP)代替免疫球蛋白hlgG外，其他與參考例I中“免疫電極的金標銀染步驟”相同。
[0025]實施例1:hIgG免疫電分析
本實施例為基于免疫親和、金屬標記和陽極溶出伏安法的檢測目標分析物hlgG的電分析，比較本發明方法與常規制備方法在免疫電極中的響應。
[0026]本實施例包括以下步驟:
(I)本發明方法:①在制備好的免疫電極上進行金標銀染反應(參見參考例1)，再進行原電池置換反應(GRRs)，免疫電極的原電池置換反應步驟如下:silver/Ab2-AuNPs/hIgG/BSA/Ab/AUp^/GCE電極上滴加6.0 uL 5.0 mmol/L的氯金酸溶液(HAuCl4),反應10分鐘，吹干用超純水洗凈，得到Au-silver/AbfAuNPs/hlgG/BSA/Abi/Aumte/GCE電極；使得在原納米金表面上又生成了納米金顆粒，對標記的納米金進行了尺寸的放大。也可類似地滴加
6.0uL 5.0 mmol/L氯金酸鉀、氯金酸鈉、亞硫酸金鈉或者亞硫酸金鉀溶液,進行同樣的GRR反應進行信號的放大；②由于生成了更多的納米金，所以在原電池置換反應之后，又可以在電極表面上進行金標銀染反應，生成更多的銀納米粒子，使得可以溶解富集到電極表面上的銀的量增加，電化學響應信號增大；將金標銀染反應和原電池置換反應交替進行4次后，最后一次金標銀染得到更多的納米銀，因而得到了更大的電化學響應信號。
[0027](2)常規制備方法:在參考例I中的免疫電極上，只進行一次金標銀染反應。
[0028](3)檢測方法:即原申請的中國發明專利“基于金屬標記和生物親和的原位陽極溶出伏安分析方法”(申請號:201310459224.4)，①在三電極系統中(工作電極為上述參考例中的金標銀染的免疫電極)，空氣中接上電化學儀器并預先施加能夠充分實現金標銀染的金屬Ag離子電沉積的陰極電位-0.3 V (vs.SCE),再將8 uL I mol/L HNO3加至免疫電極表面并導通電解池，使金屬標記物溶解為Ag+，并同時將Ag+電還原成原子態金屬Ag，從而在免疫電極表面富集上金屬銀。②直接在原工作電極表面，使用差分脈沖陽極溶出伏安法(DPV)檢測金屬銀陽極溶出為銀離子的信號，檢測條件為:-0.3 V (vs.SCE (飽和甘汞電極))沉積10 min，掃描區間為-0.3?0.7 V，獲得該工作電極上所富集到的金屬銀的陽極溶出電流信號，從而間接實現樣品中目標分析物hlgG的定量分析。
[0029]測定結果分析:結合圖2進行討論，圖2給出了兩種方法中AuNPs標記物構建的免疫電極對不同濃度抗原的信號響應，圖2(A)為本發明實施例1中常規制備方法在金納米顆粒(AuNPs)標記的hlgG免疫電極上，采用差分脈沖陽極溶出伏安法檢測標準樣品的原圖；圖2 (B)為實施例1中常規制備方法在金納米顆粒(AuNPs)標記的hlgG免疫電極上檢測得到的標準曲線圖；圖2 (C)為實施例1中本發明方法在AuNPs標記的hlgG免疫電極上，采用差分脈沖陽極溶出伏安法檢測標準樣品的原圖；圖2 (D)為實施例1中本發明方法在AuNPs標記的hlgG免疫電極上檢測得到的標準曲線圖；從圖中可知，隨著抗原濃度增加，電流響應也隨之增加；對于同一抗原濃度，本發明法的響應信號明顯大于常規制備方法；本發明中電流與抗原濃度線性范圍為0.4 fg/mL^400 ng/mL，AuNPs標記的檢測限為0.2 fg/mL(相當于在6 uL樣品中只有5個蛋白質分子，信噪比為3)，而常規制備方法檢測線則為1.2 fg/mL ;本發明方法線性范圍寬，檢測限低，結合原申請的國家發明專利“基于金屬標記和生物親和的原位陽極溶出伏安分析方法”(申請號:201310459224.4)的電化學檢測方法使得檢測下限達到了單分子水平。
[0030]實施例2基于本發明方法的甲胎蛋白免疫電分析
本實施例為基于免疫親和、金屬標記和陽極溶出伏安法的檢測甲胎蛋白的電分析，用本發明的技術方案得到甲胎蛋白電極中的響應。
[0031]本實施例包括以下步驟:
樣品測定:
1.金標銀染的甲胎蛋白分析:
(I)除用甲胎蛋白(hAFP)代替免疫球蛋白hlgG外，其他與實施例1中的“本發明方法”的實施步驟相同。即①在制備好的免疫電極上進行金標銀染反應(參見參考例2)，再進行原電池置換反應(GRRs )，免疫電極的原電池置換反應步驟如下:s i I ver/Ab2-AuNP s/h I gG/BSA/Ab/AUp^/GCE電極上滴加6.0 uL 5.0 mmol/L的氯金酸溶液(HAuCl4),反應10分鐘，吹干用超純水洗凈，得到Au-silver/AbfAuNPs/hlgG/BSA/Abi/Aumte/GCE電極；使得在原納米金表面上又生成了納米金顆粒，對標記的納米金進行了尺寸的放大；也可類似地滴加
6.0uL 5.0 mmol/L氯金酸鉀、氯金酸鈉、亞硫酸金鈉或者亞硫酸金鉀溶液,進行同樣的GRR反應進行信號的放大；②由于生成了更多的納米金，所以在原電池置換反應之后，又可以在電極表面上進行金標銀染反應，生成更多的銀納米粒子，使得可以溶解富集到電極表面上的銀的量增加，電化學響應信號增大；將金標銀染反應和原電池置換反應交替進行4次后，最后一次金標銀染得到更多的納米銀，因而得到了更大的電化學響應信號。
[0032](2)常規制備方法:除用甲胎蛋白(hAFP)代替免疫球蛋白hlgG外，其他與實施例I中的“常規制備方法”的實施步驟相同。即在參考例2中的免疫電極上，只進行一次金標銀染反應。
[0033](3)檢測方法:除用甲胎蛋白(hAFP)代替免疫球蛋白hlgG外，其他與實施例1中的“檢測方法”的實施步驟相同。
[0034]測定結果分析:結合圖3進行討論，圖3給出了兩種方法中AuNPs標記物構建的免疫電極對不同濃度抗原的信號響應，圖3(A)為實施例2中常規制備方法采用AuNPs標記的甲胎蛋白(hAFP)免疫電極上檢測標準樣品的原圖；圖3(B)為實施例2中常規制備方法采用AuNPs標記的甲胎蛋白(hAFP)免疫電極上檢測標準曲線圖；圖3(C)為實施例2中本發明方法采用AuNPs標記的甲胎蛋白(hAFP)免疫電極上檢測標準樣品的原圖；圖3 (D)為實施例2中本發明方法采用AuNPs標記的甲胎蛋白(hAFP)免疫電極上檢測標準曲線圖；從圖中可知，隨著抗原濃度增加，電流響應也隨之增加；對于同一抗原濃度，本發明法的響應信號明顯大于常規法；本發明中電流與抗原濃度線性范圍為0.5 fg/mL飛00 ng/mL, AuNPs標記的檢測限為0.1 fg/mL (相當于在6 uL樣品中只有5個蛋白質分子，信噪比為3)，而常規制備方法的檢測下限則為1.6 fg/mL ;本發明方法線性范圍寬，檢測限低，結合原申請的發明專利“基于金屬標記和生物親和的原位陽極溶出伏安分析方法”(申請號:201310459224.4)的電化學檢測方法使得具有更低的檢測下限。
[0035]綜上所述，本發明涉及的分析方法靈敏度高、操作簡便、通用性好，與“基于金屬標記和生物親和的原位陽極溶出伏安分析方法”發明專利(申請號:201310459224.4)方法的聯用，實現了金屬標記物用于電化學免疫分析檢測單分子水平的蛋白質，并且在實際血樣中的檢測結果令人滿意，可廣泛用于基于生物親和、金屬標記和陽極溶出伏安法的單目標分析物檢測與多目標分析物多通道檢測。
【權利要求】
1.一種蛋白質單分子水平安培免疫分析方法，其特征在于，包括以下步驟: ①以免疫電極為工作電極，在工作電極上以納米金標記物為中心，進行金標銀染和原電池置換反應的多次反應，通過銀染層和金鹽的原電池置換反應，選擇性地放大納米金標記物的尺寸，可顯著增大銀染量和放大金屬標記物電化學分析信號； ②將這種多重放大的方法用于電化學免疫分析，用原位陽極溶出伏安法獲得該工作電極上所富集到的金屬層的陽極溶出電流信號，從而間接實現樣品中目標分析物的定量分析，使得電化學方法可以檢測低至單分子水平的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的蛋白質單分子水平安培免疫分析方法，其特征在于，所述金鹽為能置換銀染層的金鹽溶液。
3.根據權利要求2所述的蛋白質單分子水平安培免疫分析方法，其特征在于，所述金鹽的濃度為I umol/L稀溶液?飽和溶液。
4.根據權利要求2或3所述的蛋白質單分子水平安培免疫分析方法，其特征在于，所述金鹽為氯金酸、氯金酸鉀、氯金酸鈉、亞硫酸金鈉或者亞硫酸金鉀。
5.根據權利要求4所述的蛋白質單分子水平安培免疫分析方法，其特征在于，所述金鹽的濃度為lumol/L?0.lmol/Lo
6.根據權利要求1所述的蛋白質單分子水平安培免疫分析方法，其特征在于，所述金鹽體積為IuL?1mL體積的能置換銀染層的溶液。
7.根據權利要求1?6之一所述的蛋白質單分子水平安培免疫分析方法，其特征在于，所述納米金標記物的制備步驟為:將金納米粒子與生物配體結合成生物復合物，所述生物配體為抗原或抗體，或蛋白質。
8.根據權利要求1?6所述的蛋白質單分子水平安培免疫分析方法，其特征在于，使用陽極溶出伏安法對金屬離子進行定量分析時，采用I組，2組或2組以上電極，每組電極之間形成一個測量通道；每組電極為兩電極或三電極體系。
9.根據權利要求1?8所述的蛋白質單分子水平安培免疫分析方法，其特征在于，所述目標分析物可為蛋白質。
10.根據權利要求1?9所述的蛋白質單分子水平安培免疫分析方法，其特征在于，所述金標銀染和原電池置換反應的次數為f 10次。
【文檔編號】G01N33/68GK104181292SQ201410426738
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月27日 優先權日:2014年8月27日
【發明者】謝青季, 覃曉麗, 劉玲, 徐愛貴, 譚月明, 傅迎春, 陳超, 姚守拙 申請人:湖南師范大學