一種鰻弧菌快速檢測系統的制備與應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術和免疫學領域，更具體地，本發明涉及一種媛弧菌快速檢測 系統的制備與應用。
【背景技術】
[0002] 媛弧菌（Vibrio anguillarum)是目前在水產養殖業中具有極大危害的革蘭氏陰 性桿菌，能夠感染包括海水魚和淡水魚在內的多種魚類。該菌在世界不少國家和地區都引 起了不同程度的病害爆發，近年來給我國水產養殖業造成了極大的危害。
[0003] 建立媛弧菌快速、簡單、準確的檢測方法，對水產養殖品種媛弧菌病害控制具有重 要的意義。目前，傳統的檢測方法，是對病原微生物富集，根據菌落形態特征和生理生化特 征或結合16S rDNA測序來判定病原種類。此外，免疫學檢驗技術被廣泛的應用到病原微生 物的檢測中。包括細菌凝集實驗、免疫擴散實驗、免疫英光技術、免疫印跡技術、酶聯免疫吸 附技術巧LISA)等。部分研究工作者采用免疫學檢驗方法對媛弧菌進行檢測，建立了媛弧 菌免疫組化檢驗方法、（間接）酶聯免疫吸附法巧LISA)等檢測方法。近幾年，有人報道了 W聚合酶鏈反應（PCR)或環介導等溫擴增技術（LAM巧對媛弧菌特異性基因進行檢測。
[0004] 傳統的細菌學生理生化鑒定方法費時繁瑣，而一般的免疫酶試驗、免疫英光法及 ELISA等方法雖然可W用于媛弧菌的檢測，但其操作程序較復雜、檢測相對費時費力。PCR 技術簡便、快速、敏感性高，但對儀器設備及操作技能均要求較高，在水產養殖的基層單位 難W大面積推廣，LAMP技術雖然不需要特殊儀器設備，但操作時易出現假陽性。
[0005] 20世紀90年代初，膠體金免疫層析技術（GICA)逐漸發展起來。該方法是一種W 膠體金為標記物的快速免疫結合分析技術，具有特異性強、靈敏度高、簡便快速、肉眼判讀、 穩定性高等優點。相比較傳統的幾種媛弧菌的檢測方式，膠體金免疫技術在檢測時間W及 操作簡便性上占了極大的優勢。但是，膠體金免疫技術需要借助特異性良好、靈敏度良好且 適用于制備金標抗體的抗體作為制備基礎。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于提供一種媛弧菌快速檢測系統的制備與應用。
[0007] 在本發明的第一方面，提供一種用于檢測媛弧菌的測試板，其包括固相載體， W及：（1)包被于金標墊的金標抗體，其是特異性抗媛弧菌的單克隆抗體，其由保藏號為 CCTCC N0:C201477的雜交瘤細胞株產生；和（2)包被于檢測線的抗體，其是特異性抗媛弧 菌的單克隆抗體，其由保藏號為CCTCC N0:C201478的雜交瘤細胞株產生。
[000引在一個優選例中，所述的測試板包括：固相載體（支撐板），W及位于固相載體上 的；樣品墊，金標墊，分析膜，吸水墊；所述的分析膜上設置檢測線和質控線。
[0009] 在另一優選例中，所述的質控線上標記與媛弧菌抗體免疫源相同的羊抗鼠第二抗 體。
[0010] 在另一優選例中，所述的固相載體是PVC塑料板。
[0011] 在另一優選例中，所述的分析膜為硝酸纖維素膜。
[0012] 在另一優選例中，所述的測試板的固相載體上，所述的樣品墊，金標墊，分析膜，吸 水墊是有序排列的，使得樣品在加樣于樣品墊后，依次流經金標墊、分析膜、吸水墊。
[0013] 在另一優選例中，所述測試板上各組件的疊放順序為；固相載體置于最底層，其 上黏貼有分析膜；分析膜兩端分別放置膠體金結合墊和吸水紙，膠體金結合墊和吸水紙均 與分析膜重合3± 1mm;膠體金結合墊的另一端放置樣品墊，樣品墊與膠體金結合墊重合 3 + 1mm。
[0014] 在另一優選例中，所述吸水墊為濾紙纖維。
[0015] 在另一優選例中，金標抗體W 0. 3 + 0.1 mg/mL的量均勻涂布于玻璃纖維素膜、聚 醋膜或濾紙纖維，獲得金標墊；
[0016] 包被于檢測線的抗體W 1 ±0. 2mg/mL的濃度、W 2 + 0. 3 μ L/cm噴涂于硝酸纖維素 膜上預定的檢測線位置。
[0017] 在本發明的另一方面，提供所述的測試板的用途，用于檢測媛弧菌，或用于制備檢 測媛弧菌的試劑盒。
[0018] 在本發明的另一方面，提供一種用于檢測媛弧菌的檢測試劑盒，其中包括所述的 用于檢測媛弧菌的測試板。
[0019] 在本發明的另一方面，提供特異性識別媛弧菌的單克隆抗體，其是由保藏號為 CCTCC N0:C201477的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體；和/或其是由保藏號為CCTCC N0:C201478的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體。
[0020] 在本發明的另一方面，提供產生特異性識別媛弧菌的單克隆抗體的雜交瘤細胞 株，其在中國典型培養物保藏中必的保藏號是CCTCC NO:C201477 ;和/或其在中國典型培 養物保藏中必的保藏號是CCTCC NO:C201478。
[0021] 在本發明的另一方面，提供所述的單克隆抗體的用途，用于制備特異性檢測媛弧 菌的檢測試劑盒。
[0022] 在本發明的另一方面，提供一種檢測媛弧菌的方法，所述方法包括；將待測樣品加 樣于所述的測試板的樣品墊中，觀察分析膜上檢測線和質控線，若檢測線和質控線同時顯 色，則認為待測樣品包含媛弧菌。
[0023] 本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。
【附圖說明】
[0024] 圖1、膠體金快速測試板的組裝步驟。其中T為檢測線，包被媛弧菌單克隆抗體；C 為質控線，包被羊抗鼠 IgG ;陽性檢測結果為T、C線同時顯色；陰性檢測結果僅C線顯色；無 效檢測結果則C線不顯色。
[00巧]圖2、膠體金快速測試板特異性檢測結果。
[0026] 圖3、膠體金快速測試板靈敏度檢測結果。
[0027] 圖4、魚體組織與菌液混合物的檢測。
【具體實施方式】
[002引本發明人經過深入的研究，篩選到了特異性良好、靈敏度良好且適用于免疫膠體 金技術的抗體。在此基礎上，本發明人基于膠體金免疫檢測技術，建立了針對媛弧菌的簡 便、快速、敏感、準確診斷檢測媛弧菌的方法，從而實現早期控制媛弧病的蔓延，在水產養殖 媛弧菌病害控制中具有重要的意義。
[0029] 本領域技術人員均了解，細菌包含有多種蛋白抗原，每種抗原可能含有多個抗原 表位（抗原決定簇），因此，針對一種細菌可W獲得難W計數的抗體，送些抗體對抗原（細 菌）的結合特性（如特異性等）均可能是不同的。因此，針對一種細菌，往往需要進行大量 的反復比較、篩選和鑒定，才能找到適合于特異性結合、并適用于產業化應用的單抗。
[0030] 本發明人在研究中發現，一些利用媛弧菌制備的抗體或利用媛弧菌的裂解蛋白制 備的抗體，當用于實際檢測時，遭遇到與媛弧菌結合特性差的問題，送可能是由于待測樣品 中與該抗體相應的抗原決定簇被包在蛋白結構內部，無法接觸到抗體造成的。送給該菌株 的檢測帶來了難題，難W找到一種具備對于媛弧菌的識別能力且具備該菌株特異性（不與 其它菌株發生交叉反應）的抗體。另外，適用于普通化ISA技術的單克隆抗體與適用于基 于免疫膠體金技術的單克隆抗體也存在差異，不能交互使用。例如，一對抗體適用于一般的 雙夾必化ISA法檢測，但當應用于基于免疫膠體金的雙夾必化ISA技術時，則可能并沒有良 好的檢測效果。
[0031] 針對上述技術難題，本發明人經過大量的單克隆篩選和驗證，從而獲得本發明的 雜交瘤細胞株保藏號為CCTCC N0:C201477和雜交瘤細胞株保藏號為CCTCC N0:C201478的 單克隆抗體，該兩個單克隆抗體針對兩個來自媛弧菌的不同抗原決定簇。W所述的單克隆 抗體為基礎，可制備準確地檢測媛弧菌的測試板及檢測試劑盒。
[0032] 本發明的單克隆抗體利用雜交瘤技術來制備。在獲得了所述雜交瘤的情況下，可 按照常規的動物細胞培養方法，體外培養擴增所述的雜交瘤細胞，從而使之分泌所述的單 克隆抗體。作為一種實施方式，所述的單克隆抗體可W由下列制備方法制備：
[0033] (1)提供佐劑預處理的小鼠；
[0034] (2)在小鼠腹腔內接種所述的雜交瘤細胞并分泌單克隆抗體；
[0035] (3)抽取腹水，分離獲得所述的單克隆抗體。
[0036] 作為一種方式，從腹水中分離單克隆抗體的方法是：收集腹水，經硫酸倭，接著用 Protein G層析柱純化，獲得高純度的抗媛弧菌的單克隆抗體。
[0037] 在獲得了本發明的抗體后，本領域技術人員可W通過本領域已知的測序技術來獲 得該單抗的序列信息，例如測得其重鏈和輕鏈的序列。從而可應用生物工程技術人工制備。
[0038] 本發明的單克隆抗體可W利用重組方法制備或利用多膚合成儀合成。本領域人員 均了解，在得到了所述的單克隆抗體的雜交瘤細胞系或通過測序等手