一種半定量免疫膠體金試紙條及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及農產品檢測技術領域，尤其設及一種半定量免疫膠體金試紙條及其應 用。
【背景技術】
[0002] 氣哇諾酬類(FluomquinoIones，FQNs)抗生素是一類廣譜的化學合成抗菌藥物，是 哇諾酬類抗生素在其主環6或8位加入氣原子后的衍生物。由于氣哇諾酬類藥物價格低廉且 治療效果好，因此近年來被廣泛應用到水產養殖中預防、治療魚類疾病。但是在長期使用過 程中，人們逐漸發現該類藥物的過量或不當使用會造成動物產品中殘留和蓄積。人食用有 FQ化殘留的食品后，人體正常的腸道菌群被破壞而引起腸道功道素亂，此類藥物影響兒童 骨骼發育，易引起肝損害和關節病變，還可誘發癒痛和神經癥狀;人類長期食用含較低濃度 FQ化藥物的食品，容易誘導細菌耐藥性的傳遞，甚至產生超級細菌，從而影響該類藥物的臨 床療效。
[0003] 目前，HPLC法和LC-MS/MS法是國際上最常用來測定氣哇諾酬類藥物殘留的方法， LC-MS/MS法可W利用待測分子的結構來定性，可W排除ELISA和HPLC法檢測的假陽性結果， 用W確證檢測結果。但運兩種檢測方法設及到大量的有機溶劑處理，過程比較復雜，周期也 比較長，操作時需要專口的技術人員，難W滿足現代檢測快速、簡捷、現場化的要求。
[0004] ELISA測定的基礎是抗原抗體反應，該法精確、靈敏，檢測時間大大縮短，但是 ELISA法中酶的活性易受反應條件影響，由此易造成測定結果重復性較差。此外化ISA試劑 壽命短，因此需要低溫保藏。
[0005] 基于抗原抗體特異性反應建立起來的免疫學測定方法靈敏度較高，特異性強，試 樣預處理簡單，分析時間短，使用方便。因此，在現場監控和基層的大規模篩選檢測中，免疫 學檢測方法更實際。
[0006] 膠體金免疫層析法是在免疫滲濾技術的基礎上建立的一種簡易快速的免疫學檢 測技術，除了具備酶聯免疫法的諸多優點外，還克服了酶聯免疫法的一些不足。該方法將反 應所需要的原料的全部或大部分均已整合到試劑中，反應通常只需數分鐘，測試結果W肉 眼可見的顯色條帶來判斷。具有簡便快速、操作簡單、特異性強、不需要額外設備等優點。
[0007] 不同的國家和地區對FQNs殘留限量要求不同，如美國FDA于2005年宣布禁止用于 治療家禽細菌感染的抗菌藥物恩諾沙星的銷售和使用，對海產品中FQNs殘留零容忍，對方 法檢出限要求為扣g · kg-i。我國農業部235號公告中規定了環丙沙星、達氣沙星、恩諾沙星、 沙拉沙星、二氣沙星、嗯哇酸和氣甲哇等7種哇諾酬藥物(QNs)在動物肌肉中的最高殘留限 量(M化)為10~50化g · kg-i;而在奶、肝、腎和蛋中的ML分別為30~100、80~1900、80~ 3000和50yg . kg-i;不同人群對食用農產品質量安全的需求也有差異，尤其是孕婦、兒童和 特殊體質人群，即使攝入較低濃度Q化藥物的食品，也可能產生一些不良反應。

【發明內容】

[0008] 本發明針對不同國家和地區對藥物殘留限量要求不同，提供了一種半定量免疫膠 體金試紙條及其應用，該試紙條具有兩條控制線，符合兩種不同限量要求，重現性好，檢測 時間短，適合現場快速檢測。
[0009] 本發明提供了一種免疫膠體金試紙條，包括控制線，所述控制線至少為兩條，不同 控制線上包被有不同濃度的二抗。
[0010] 該免疫膠體金試紙條包括:樣品墊、標記物墊、反應膜和吸樣墊;相鄰各部分間有 l-2mm的重疊 W保證層析作用從樣品墊到吸水墊部位的順利進行。
[0011] 所述免疫膠體金試紙條還包括標記物墊和檢測線，所述檢測線上包被有抗原，所 述標記物墊上包被有能夠與所述抗原反應的膠體金標記的抗體。
[0012] 進一步，當藥殘限量值與抗體的最低檢測限接近的情況下，解決Cl顯色太淺的運 一問題的辦法是加入其它與檢測線上抗原不反應的抗體，提高質控線顯色效果的穩定性， 提高半定量試紙條的檢測靈敏度，同時可降低生產線調試的難度。
[0013] 作為優選，所述標記物墊上還包被有與所述抗原不反應的膠體金標記的抗體。進 一步地，所述抗原不反應的膠體金標記的抗體為橫胺二甲喀晚多克隆兔抗或巧喃妥因代謝 物鼠抗。
[0014] 作為優選，所述膠體金標記的抗體為膠體金標記的抗氣哇諾酬類藥物單克隆抗 體;所述抗原為氣哇諾酬類藥物與載體蛋白偶聯的偶聯物。
[0015] 具體地，所述免疫膠體金試紙條反應膜的檢測線(T線)處包被有環丙沙星-卵清蛋 白偶聯物(CIP-0VA)或環丙沙星-牛血清蛋白偶聯物(CIP-BSA)，所述反應膜的質控線(C1和 C2線)處包被有二抗。
[0016] 所述抗氣哇諾酬類藥物單克隆抗體由雜交瘤細胞株或其傳代細胞株分泌產生;所 述雜交瘤細胞株命名為雜交瘤細胞株5H化犯8D7H12，已于2015年8月26日保藏于中國典型 培養物保藏中屯、（Qiina Center for Type Qilture Collection,簡稱CCTCC)，保藏編號為 CCTCC NO. C2015118;中國典型培養物保藏中屯、的地址為：中國.武漢.武漢大學。
[0017] 所述雜交瘤細胞株的制備方法，包括：
[0018] (1)將牛血清白蛋白和環丙沙星混合制備偶聯物，再用所述偶聯物免疫動物，獲得 能夠產生抗哇諾酬類藥物抗體的脾細胞；
[0019] (2)將所述脾細胞與骨髓瘤細胞融合，經篩選、克隆后，獲得所述雜交瘤細胞株；
[0020] 其中，所述牛血清白蛋白與環丙沙星的投料比為1:10~30;所述偶聯物的偶聯比 為2~6:1。
[0021] 作為優選，所述的篩選和克隆在無抗菌素的條件下進行。
[0022] 具體地，所述的動物為BALB/c小鼠。
[0023] 所述單克隆抗體的亞型為IgGiA鏈，與哇諾酬類藥物有特異性反應。所述單克隆抗 體通過體外培養的方式獲得。
[0024] 所述的氣哇諾酬類藥物為環丙沙星、恩諾沙星、氧氣沙星、諾氣沙星、丹諾沙星、沙 拉沙星、麻保沙星、培氣沙星、洛美沙星、雙氣沙星、依諾沙星、氣甲哇、加替沙星、嗯哇酸、氣 羅沙星和司帕沙星中的至少一種。
[00巧]作為優選，所述膠體金的粒徑范圍為20~80nm。
[00%]具體地，所述控制線上包被有羊抗鼠 IgG或羊抗兔IgG。
[0027]本發明提供了一種免疫膠體金試劑板，包含所述的免疫膠體金試紙條。
[002引本發明試劑條和試劑板采用層析式抗體免疫競爭原理，通過抗原和金標抗體反應 顯色，特異性檢測樣品中的氣哇諾酬類藥物殘留水平。
[0029] 本發明還提供了所述免疫膠體金試紙條在檢測食用農產品中藥物殘留的應用。所 述食用農產品為畜禽肉或水產品。
[0030] 與現有技術相比，本發明具有的有益效果為：
[0031] (1)本發明免疫膠體金試紙條能夠對食用農產品中氣哇諾酬類藥物殘留量實現半 定量快速檢測或現場檢測。
[0032] (2)本發明免疫膠體金試紙條靈敏度高，特異性好，對農產品中16種氣哇諾酬類藥 物的最低檢出限可達1~lOyg · kg-i，適用于各類企業及檢測機構;對青霉素、氯霉素、鏈霉 素、四環素或橫胺喀晚等抗菌素的交叉反應率均低于1%，可見，本發明免疫膠體金試紙條 對氣哇諾酬類藥物反應具有高度專一性。
[0033] (3)本發明免疫膠體金試紙條的操作簡單快捷，將反應所需的大部分原料整合到 PVC背襯中，滴樣后，抗原抗體反應在固相膜上快速進行，大大縮短檢樣時間，且樣品無需特 殊處理，滴樣后1-5分鐘即可用肉眼通過判斷硝酸纖維素膜上的檢測線和控制線的顏色深 淺讀取結果。檢測實施過程不依賴任何實驗設備，普通人員均可操作，不需專業培訓。
[0034] (4)本發明免疫膠體金試紙條成本低，易推廣，生產工藝簡單，流程成熟，投資少， 收效快。
[0035] (5)本發明為解決Cl顯色太淺的問題又在標記物墊上包被了與檢測線上抗原不反 應的抗體，提高了質控線顯色效果的穩定性，提高了半定量試紙條的檢測靈敏度，同時也降 低了生產線調試的難度。
【附圖說明】
[0036] 圖1為氣哇諾酬類藥物免疫膠體金快速檢測試劑板背襯的結構示意圖，其中1為樣 品墊，2為膠體金結合墊，3為硝酸纖維素膜，4為檢測線(Τ)，5為高含量控制線(C2)，6為低含 量控制線(Cl )，7為吸水墊，8為不干膠，9為PVC底板。
[0037] 圖2為氣哇諾酬類藥物免疫膠體金快速檢測試劑板操作示意圖，其中S為加樣孔， Cl、C2為控制區，T為檢測區。
[0038] 圖3為氣哇諾酬類藥物免疫膠體金快速檢測試劑板結果判定示意圖；
[0039] 其中，打為低含量控線、C2為高含量控制線，T為檢測線。
[0040] 圖3.a,T比Cl顯色深，表示樣品中FQ化殘留量X<Ci;圖3.b T與Cl顯色一樣深，表示 樣品中FQ化殘留量X = Ci;圖3.C T比Cl顯色淺，但比C2顯色深，表示樣品中FQ化殘留量Ci<X <C2;圖3.d T與C2顯色一樣深，表示樣品中FQ化殘留量X = C2;圖3.e T比C2顯色淺，表示樣 品中FQ化殘留量X>C2;圖3.f T不顯色，表示樣品中FQ化殘留遠高于C2;圖3.g表示試劑板已 部分失效;圖3. h表示試劑板已完全失效。
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