專利名稱：蛋白質測定用試驗片及其制造方法
技術領域：
本發明涉及測定含蛋白質試樣(例如血液和尿等體液、含蛋白質飲料、工廠廢水)中存在的蛋白質所使用的蛋白質測定用試驗片及其制造方法。
背景技術：
測定生物體試樣中的蛋白質，在病理學的診斷方面是重要的。例如，在肝臟功能低下的情況下，血清白蛋白量下降，而另一方面，在腎炎、腎變病綜合癥、結石、腫瘤等的腎-尿路疾病、循環系統及中樞神經系統的疾病等的情況下，尿中的蛋白質的量增加。因而，測定白蛋白等蛋白質，在這些疾病的診斷中可以成為重要的指標。
在蛋白質測定的領域中，已知使用蛋白質誤差指示劑的簡便的測定方法。在該測定方法中，作為蛋白質誤差指示劑，例如使用著四溴酚藍(TBPB)，如果舉一個例子，使用TBPB的尿試紙，作為一次性篩選用被廣泛地使用著。當存在蛋白質時，在pH3附近，就引起TBPB的酚性羥基的解離，從黃色變為藍色，就可以檢測出蛋白質。
但是，將TBPB作為指示劑使用的試紙，因為對于臨床必須的10～20mg/dl的低濃度蛋白質的檢測靈敏度不夠，所以有時不能正確地檢測蛋白質。例如，在與色表比較而進行的目測判斷中，因為陰性蛋白質與痕跡蛋白質的顏色相近，所以難以區別而判斷有困難。另一方面，即使在使用尿試紙的測定裝置時，因為TBPB的靈敏度低，而經常有判斷錯誤的情況。
因此，希望有靈敏度更高的可以定量低濃度蛋白質的技術。
發明內容
為了解決上述課題，本發明者進行了深入研究，結果本發明者發現，如果使試驗片上含有表面活性劑，就可以以高靈敏度測定低濃度的蛋白質，從而完成了本發明。
即，由本發明第一方面提供的蛋白質測定用試驗片，是用于定量或半定量地測定蛋白質、且含有酸性pH指示劑的蛋白質測定用試驗片，其中，作為用于提高蛋白質發色靈敏度的增感劑，含有表面活性劑。
本發明的第二方面提供一種蛋白質測定試驗片的制造方法，是制造用于定量或半定量地測定蛋白質的蛋白質測定用試驗片的方法，其中在使含有酸性pH指示劑和增感劑的含浸液含浸于吸收性載體之后、通過使其干燥來制造蛋白質測定用試驗片的方法中，作為上述增感劑，使用表面活性劑。
作為本發明中可以使用的酸性pH指示劑來說，可以列舉出例如三苯甲烷類指示劑。作為三苯甲烷類指示劑來說，典型的可以列舉出用下述化學式(1)表示的物質。
在化學式(1)中，X1是鹵素、硝基或亞硝基，X2和X3是相同或不同的鹵素。
在本發明中，作為三苯甲烷類指示劑，優選使用由下述化學式(2)表示的四溴酚藍(TBPB)。
含浸液中的酸性pH指示劑(例如TBPB)的濃度，沒有特別的限定，但典型的是0.1～5mM，優選為0.3～0.1mM。
作為表面活性劑(增感劑)來說，優選使用陽離子型表面活性劑，也可以除此以外還使用非離子型表面活性劑、或者取代其而使用非離子型表面活性劑。
作為陽離子型表面活性劑來說，例如可以使用季銨鹽。作為季銨鹽來說，可以列舉例如烷基二甲基芐基銨、烷基三甲基銨鹽、二烷基二甲基銨鹽、芐烷銨鹽和咪唑鹽。作為陽離子型的表面活性劑來說，也可以使用脂肪族胺鹽。
作為非離子型表面活性劑來說，可以使用醚型、醚酯型、酯型和含氮型中的任意一種。
作為醚型表面活性劑來說，可以列舉例如聚氧化乙烯烷基醚、聚氧化乙烯仲醇醚、聚氧化乙烯烷基苯醚、聚氧化乙烯甾醇醚、聚氧化乙烯含水羊毛脂衍生物、烷基酚甲醛縮合物的氧化乙烯衍生物、聚氧化乙烯聚氧化丙烯嵌段共聚物和聚氧化乙烯聚氧化丙烯烷基醚。
作為醚酯型表面活性劑來說，可以列舉例如聚氧化乙烯脂肪酸甘油酯、聚氧化乙烯蓖麻籽油、聚氧化乙烯硬化蓖麻籽油、聚氧化乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯和聚氧化乙烯山梨糖醇脂肪酸酯。
作為酯型表面活性劑來說，可以列舉例如聚乙二醇脂肪酸酯、脂肪酸單甘油酯、聚甘油脂肪酸酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯和蔗糖脂肪酸酯。
作為含氮型表面活性劑來說，可以列舉例如脂肪酸烷醇酰胺、聚氧化乙烯脂肪酰胺、聚氧化乙烯烷基胺和烷基胺氧化物。
作為本發明中的陽離子型表面活性劑來說，典型的是使用芐基三甲基溴化銨、十六烷基三甲基溴化銨、十二烷基三甲基溴化銨或十四烷基二甲基芐基氯化銨(Zephiramine)，作為非離子型表面活性劑來說，典型的是使用聚乙二醇。當然，也可以同時使用多種表面活性劑，在此時，優選將陽離子型表面活性劑與非離子型表面活性劑組合起來使用。典型的是，將作為陽離子型表面活性劑的芐基三甲基溴化銨與作為非離子型表面活性劑的聚乙二醇組合起來使用。
含浸液中的增感劑(表面活性劑)的濃度，沒有特別的限制，典型的是0.01～5wt％、優選為0.01～1wt％。
作為增感劑來說，除了表面活性劑以外，還可以使用聚碳酸酯或聚乙烯醇等的高分子材料。
含浸液的pH值，設定為比酸性pH指示劑的pKa值稍低的值。在使用TBPB作為酸性pH指示劑時，含浸液的pH值為2.0～4.5、優選為2.0～3.5。
作為緩沖劑來說，在含浸液的pH(例如pH2.0～4.5的范圍)中，具有良好的緩沖能力，只要是不阻礙酸性pH指示劑與蛋白質反應的物質，什么物質都可以。作為緩沖劑來說，可以使用例如甘氨酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、琥珀酸緩沖液、蘋果酸緩沖液或酒石酸緩沖液。含浸液中的緩沖劑的濃度，沒有特別的限制，典型的是0.1～1.5M、優選為0.3～1M。
作為吸收性載體來說，可以使用不含蛋白質成分的多孔性物質，例如可以使用片狀或膜狀形態的材料。作為多孔性物質來說，可以列舉例如紙狀物、泡沫(發泡體)、織布狀物、無紡布狀物與編織狀物。作為用于形成吸收性載體的材料來說，可以列舉例如棉、麻、纖維素、硝基纖維素、乙酸纖維素、石棉、玻璃纖維、二氧化硅纖維、碳纖維、硼纖維、聚酰胺、芳族聚酰胺、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、再生纖維素(人造絲)、聚酯、尼龍、聚丙烯酸、聚丙烯酸酯和聚烯烴。這些吸收性載體的形狀，沒有特別的限定，通常是矩形、長方形、圓形或橢圓形。
本發明的蛋白質測定用試驗片，可以直接使用，也可以粘接在非吸收體上來使用。
作為非吸收體來說，可以使用例如片狀或膜狀形態的非吸收體。作為用于形成非吸收體的材料來說，可以列舉例如聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚酯、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚偏氯乙烯與聚苯乙烯。
具體實施例方式
實施例(實施例1)在本實施例中，使白蛋白濃度為0.3mg/dl(陰性)或15mg/dl(陽性)的尿含浸于試驗片中，對其分別測定了反射率。試驗片是通過使含浸液含浸于濾紙(Whatman社製“3MMChr”)中之后再使其干燥而制成。作為含浸液來說，使用了相對于表1所示的基本組成添加了0.2wt％作為增感劑的陽離子型表面活性劑的芐基三甲基溴化銨的含浸液。使用色差計，以630nm作為測定波長測定反射率。測定結果如表2所示。
(實施例2)在本實施例中，除了使用相對于表1的基本組成添加0.01wt％作為增感劑的陽離子型表面活性劑即十六烷基三甲基溴化銨來作為含浸液以外，與實施例1同樣地測定了反射率。其結果示于表2。
(實施例3)在本實施例中，除了使用相對于表1的基本組成添加0.01wt％作為增感劑的陽離子型表面活性劑即十二烷基三甲基溴化銨來作為含浸液以外，與實施例1同樣地測定了反射率。其結果示于表2。
(實施例4)在本實施例中，除了使用相對于表1的基本組成添加0.5wt％作為增感劑的非離子型表面活性劑即聚乙二醇來作為含浸液以外，與實施例1同樣地測定了反射率。其結果示于表2。
(實施例5)在本實施例中，除了同時使用相對于表1的基本組成添加作為增感劑的0.2wt％陽離子型表面活性劑即芐基三甲基溴化銨和0.5wt％非離子型表面活性劑即聚乙二醇來作為含浸液以外，與實施例1同樣地測定了反射率。其結果示于表2。
(實施例6)在本實施例中，除了同時使用相對于表1的基本組成添加作為增感劑的0.01wt％陽離子型表面活性劑即十二烷基三甲基溴化銨和0.5wt％非離子型表面活性劑即聚乙二醇來作為含浸液以外，與實施例1同樣地測定了反射率。其結果示于表2。
(實施例7)在本實施例中，除了同時使用相對于表1的基本組成添加作為增感劑的0.01wt％陽離子型表面活性劑即十四烷基二甲基芐基氯化銨和0.5wt％非離子型表面活性劑即聚乙二醇來作為含浸液以外，與實施例1同樣地測定了反射率。其結果示于表2。
(比較例1)在本比較例中，除了使用基本組成(不含表面活性劑(增感劑))作為含浸液以外，與實施例1同樣地測定了反射率。其結果示于表2。
表1基本組成
表2測定結果 由表2可知，白蛋白濃度為15mg/dl時的反射率，含有表面活性劑時，與不含表面活性劑時相比較小。因此，陰性時(0.3mg/dl)與陽性時(15mg/d1)的差分 含有表面活性劑時是不含表面活性劑時的2倍左右。因此可以說，在含有表面活性劑的情況下，針對白蛋白的靈敏度變高，即使白蛋白濃度為10～20mg/dl左右的低濃度，也能夠適當地檢測白蛋白。特別是，單獨使用陽離子型表面活性劑、或者除此之外再同時使用非離子型表面活性劑的情況下，白蛋白的檢測靈敏度變高。由此出發，作為增感劑來說，可以說優選的是使用陽離子型表面活性劑。
另外，各實施例中的實驗結果是關于尿樣的，但本發明不限于尿，也可以適用于定量測定含有蛋白質的各種試樣例如血液、含蛋白質飲料、工廠廢水中的蛋白質的情況。
權利要求
1.一種蛋白質測定用試驗片，用于定量或半定量地測定蛋白質，并且含有酸性pH指示劑，其特征在于作為用于提高蛋白質發色靈敏度的增感劑，含有表面活性劑。
2.如權利要求1所述的蛋白質測定用試驗片，其特征在于所述酸性pH指示劑是三苯甲烷類指示劑。
3.如權利要求2所述的蛋白質測定用試驗片，其特征在于所述三苯甲烷類指示劑是用下述化學式(1)表示的四溴酚藍，
4.如權利要求1所述的蛋白質測定用試驗片，其特征在于作為所述增感劑，含有陽離子型表面活性劑。
5.如權利要求4所述的蛋白質測定用試驗片，其特征在于所述陽離子型表面活性劑是選自芐基三甲基溴化銨、十六烷基三甲基溴化銨、十二烷基三甲基溴化銨和十四烷基二甲基芐基氯化銨中的至少一種。
6.如權利要求1所述的蛋白質測定用試驗片，其特征在于作為所述增感劑，含有非離子型表面活性劑。
7.如權利要求6所述的蛋白質測定用試驗片，其特征在于所述非離子型表面活性劑是聚乙二醇。
8.如權利要求1所述的蛋白質測定用試驗片，其特征在于作為所述增感劑，將陽離子型表面活性劑和非離子型表面活性劑組合起來使用。
9.如權利要求8所述的蛋白質測定用試驗片，其特征在于所述陽離子型表面活性劑是芐基三甲基溴化銨，所述非離子型表面活性劑是聚乙二醇。
10.一種蛋白質測定用試驗片的制造方法，它是制造用于定量或半定量地測定蛋白質的蛋白質測定用試驗片的方法，其特征在于在使含有酸性pH指示劑和增感劑的含浸液含浸于吸收性載體之后、通過使其干燥來制造蛋白質測定用試驗片的方法中，作為上述增感劑，使用表面活性劑。
11.如權利要求10所述的蛋白質測定用試驗片的制造方法，其特征在于作為所述表面活性劑，使用選自芐基三甲基溴化銨、十六烷基三甲基溴化銨、十二烷基三甲基溴化銨、十四烷基二甲基芐基氯化銨和聚乙二醇中的至少一種。
12.如權利要求11所述的蛋白質測定用試驗片的制造方法，其特征在于作為所述表面活性劑，將芐基三甲基溴化銨和聚乙二醇組合起來使用。
13.如權利要求10所述的蛋白質測定用試驗片的制造方法，其特征在于所述含浸液中的所述表面活性劑的含量，設定為0.01～5wt％。
14.如權利要求13所述的蛋白質測定用試驗片的制造方法，其特征在于所述含浸液中的所述表面活性劑的含量，設定為0.01～1wt％。
15.如權利要求10所述的蛋白質測定用試驗片的制造方法，其特征在于作為所述酸性pH指示劑，使用由下述化學式(2)表示的四溴酚藍，
16.如權利要求10所述的蛋白質測定用試驗片的制造方法，其特征在于所述含浸液中的所述酸性pH指示劑的濃度，設定為0.1～5mM。
17.如權利要求16所述的蛋白質測定用試驗片的制造方法，其特征在于所述含浸液的pH值，設定為所述酸性pH指示劑pKa以下。
18.如權利要求17所述的蛋白質測定用試驗片的制造方法，其特征在于所述含浸液的pH值設定為2.0～4.5。
全文摘要
本發明涉及用于定量或半定量地測定蛋白質、并且含有酸性pH指示劑的蛋白質測定用試驗片。該蛋白質測定用試驗片，含有表面活性劑作為提高針對蛋白質的發色靈敏度的增感劑。作為酸性pH指示劑來說，使用例如三苯甲烷類指示劑。本發明還提供一種蛋白質測定用試驗片的制造方法。該制造方法是，使含有酸性pH指示劑和增感劑的含浸液含浸于吸收性載體之后、通過使其干燥來制造蛋白質測定用試驗片。作為增感劑來說，使用表面活性劑。
文檔編號G01N33/68GK1675552SQ0381903
公開日2005年9月28日 申請日期2003年8月4日 優先權日2002年8月9日
發明者小坂秀子 申請人:愛科來株式會社