一種皮質酮含量測定試劑盒及其方法
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于生命科學領域領域，涉及一種試劑盒，具體涉及一種皮質酮含量測定試劑盒及其方法。
【背景技術】
[0002]皮質酮(CORT)是小分子抗原，在酶聯免疫吸附實驗中，不易直接包被于微孔板底部。目前市面上皮質酮酶聯免疫吸附法檢測試劑盒有直接競爭法、間接競爭法、雙抗體夾心法等類型試劑盒，并且對樣本來源有區分。
[0003]但是目前現有的這些皮質酮酶聯免疫吸附法檢測試劑盒存在有以下幾種問題:
1、種類多種，給客戶選擇增加疑惑，而針對小分子半抗原，本身比較適合的方法就是競爭法。
[0004]2、樣品來源限制性，比較若一抗是鼠抗，樣品來源于鼠，通過HRP標記的抗鼠的二抗作用就會產生假陽性結果。
[0005]3、成本高，若選擇包被抗體的方法，則浪費抗體，并且酶標抗原也會增大成本。

【發明內容】

[0006]為了克服現有技術的缺陷，本發明旨在提供一種皮質酮含量測定試劑盒及其方法，可快速準確的測算出皮質酮的含量。
[0007]為實現上述技術目的，達到上述技術效果，本發明通過以下技術方案實現:
一種皮質酮含量測定試劑盒，包括以下試劑:
皮質酮(CORT )標準品，0.5mg X I支，4 °C保存；
I倍稀釋液(I XDilut1n buffer)，20mLX 3瓶，4°C保存，由I3BS緩沖溶液組成；
50倍濃縮洗滌液(50 XWashing buffer)，20mLX I瓶，4°C保存，由I3BST緩沖溶液組成； 一抗，1.5mL X I支，由皮質酮(CORT)—抗組成；
酶標二抗，1.5mL X I支，由HRP標記山羊抗小鼠二抗組成；
TMB顯色液，12mL;
終止液(Stop solut1n)，6mLX I瓶，4°C保存，由硫酸組成。
[0008]進一步的，所述的I倍稀釋液中，？85緩沖溶液的?!1=7.4，物質的量濃度為0.0現；
進一步的，所述的50倍濃縮洗滌液中，PBST緩沖溶液由50mL，pH=7.4，物質的量濃度為
0.0lM的PBS緩沖溶液與2mL tween-20配制而成；
進一步的，所述一抗，皮質酮一抗的體積為45yL ；
進一步的，所述酶標二抗中，HRP標記山羊抗小鼠二抗的體積為30yL;
進一步的，所述終止液中，硫酸的物質的量濃度為2M。
[0009]本試劑盒應用間接競爭法測定標本中皮質酮(CORT)水平。用純化的皮質酮(CORT)標準品包被微孔板，制成固相抗原。樣品中皮質酮與固相抗原競爭抗體，再利用HRP標記的二抗催化底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的皮質酮(CORT)呈負相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值)，通過標準曲線計算樣品中皮質酮(CORT )濃度。
[0010]—種基于酶聯免疫吸附實驗測定組織、血清、血漿及相關液體樣本中皮質酮(CORT )含量的方法，包括以下步驟:
步驟I樣本的前處理；
1)血清:血液室溫自然凝固90分鐘，在轉速為3000轉/分下，離心10分鐘，收集上清，保存過程中如出現沉淀，應再次離心;每次實驗前，樣品使用10倍體積的甲醇沉淀蛋白，在轉速為3000轉/分下，離心10分鐘，取上清，氮氣吹干，20yL甲醇復溶；實驗時，用所述稀釋液(dilut1n buffer)稀釋甲醇復溶后的樣品；
2)血漿:應根據標本的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，在轉速為3000轉/分下，離心10分鐘;仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心;每次實驗前，樣品使用10倍體積的甲醇沉淀蛋白，在轉速為3000轉/分下，離心10分鐘，取上清，氮氣吹干，20yL甲醇復溶，實驗時，用所述稀釋液(dilut1n buffer)稀釋甲醇復溶后的樣品；
3)尿液:用無菌管收集，在轉速為3000轉/分下，離心10分鐘，收集上清;保存過程中如有沉淀形成，應再次離心;胸腹水、腦脊液參照實行;每次實驗前，樣品使用10倍體積的甲醇沉淀蛋白，在轉速為3000轉/分下，離心10分鐘，取上清，氮氣吹干，20yL甲醇復溶，實驗時，用所述稀釋液(dilut1n buffer)稀釋甲醇復溶后的樣品；
4)細胞培養上清:檢測分泌性的成份時，用無菌管收集，在轉速為3000轉/分下，離心10分鐘，仔細收集上清;檢測細胞內的成份時，用pH=7.2-7.4的PBS緩沖溶液稀釋細胞懸液，使細胞濃度達到100萬/mL左右;通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份;在轉速為2000-3000轉/分下，離心20分鐘左右，仔細收集上清;保存過程中如有沉淀形成，應再次離心;每次實驗前，樣品使用10倍體積的甲醇沉淀蛋白，在轉速為3000轉/分下，離心10分鐘，取上清，氮氣吹干，20yL甲醇復溶，實驗時，用所述稀釋液(dilut1n buffer)稀釋甲醇復溶后的樣品；
5)組織標本:稱取組織Ig，加入ImL，pH=7.4的PBS緩沖溶液，充分研磨;在轉速為3000轉/分下，離心10分鐘，收集上清;每次實驗前，樣品使用10倍體積的甲醇沉淀蛋白，在轉速為3000轉/分下，離心10分鐘，取上清，氮氣吹干，20yL甲醇復溶，實驗時，用所述稀釋液(dilut1n buffer)稀釋甲醇復溶后的樣品；
步驟2標準品的稀釋與加樣；
I)用甲醇作為溶劑將皮質酮標準品配制成5mg/mL的標準品母液，根據實驗使用量用該試劑盒中的所述稀釋液(dilut1n buffer)將所述母液稀釋1000倍，使其濃度達到5yg/mL(先稀釋100倍，再稀釋10倍)，并再將其稀釋成64yg/L作為標準液；
2 )設置濃度分別為 64yg/L，32yg/L，16yg/L，8yg/L，4yg/L，2yg/L 的標準曲線；
3)標準曲線每個濃度設置兩個重復，濃度稀釋采用倍比稀釋法，分別取五支EP管，各加入20(^1^所述稀釋液(dilut1n buffer)，取200yL的64yg/L標準液加入到第一根EP管混勾成32yg/L標準液，再從其中取出200yL的32yg/L標準液加入到第二根EP管混勻成16yg/L標準液，以此類推，再從其中取出200yL的16yg/L標準液加入到第三根EP管混勻成8yg//L標準液，再從其中取出200yL的8yg/L標準液加入到第四根EP管混勻成4yg/L標準液，再從其中取出200yL的8yg/L標準液加入到第五根EP管混勻成2yg/L標準液;從而得到64yg/L，32yg/L，16yg/L，8yg/L，4yg/L，2yg/L這6個濃度梯度的標準液；
步驟3樣品與抗體預結合；
用0.2%0VA將所述一抗稀釋125倍，并且再取5根EP管，分別設為標準孔、待測樣品孔、空白孔和對照孔；
標準孔:分別取130yL上述6個濃度梯度的標準液與等體積稀釋后的抗體混合；
待測樣品孔:取130μ1樣品與等體積稀釋后的所述一抗混合。
[0011 ]空白孔:取26(^1^所述稀釋液(dilut1n buffer)；
對照孔:取130yL所述稀釋液(dilut1n buffer)與等體積稀釋后的抗體混合；
將上述標準孔、待測樣品孔、空白孔和對照孔的各EP管進行室溫搖床預溫育40分鐘； 步驟4溫育；
將上述預溫育的標準孔、待測樣品孔、空白孔和對照孔的各EP管混勻后，分別取各EP管中10yL的物質加入到酶標板對應孔中，用封板膜封板后置37°C溫育90分鐘；
步驟5洗滌；
將所述的50倍濃縮洗滌液(washing buffer)用蒸饋水50倍稀釋后備用，棄酶標板中液體，吸水紙上拍干，每孔加入300yL所述濃縮洗滌液，停留I分鐘，棄液體，拍干;重復4次；步驟6加酶標二抗；
400倍稀釋所述酶標二抗，每孔加入10yL，用封板膜封板后37 °C溫育60分鐘；
步驟7 二次洗滌；
將所述的50倍濃縮洗滌液(washing buffer)用蒸饋水50倍稀釋后備用，棄酶標板中液體，吸水紙上拍干，每孔加入300yL所述濃縮洗滌液，停留I分鐘，棄液體，拍干;重復4次；步驟8顯色；
每孔分別加入10yL所述TMB顯色液，混勻，37 °(:避光顯色15-20分鐘；
步驟9終止；
每孔分別加50yL所述終止液，終止反應(此時藍色立轉黃色)；
步驟1測定；