專利名稱：分子結構和功能的測定方法
分子結構和功能的測定方法本發明涉及測量跨過細胞膜或脂雙層(lipid bilayer)的轉運過程的方法，其至少包含具有頂面和背面和多個納米孔或微孔的基底和從細胞膜的兩面均可進入的覆蓋所述多個孔的細胞膜。多種重要的生物反應，如能量轉換、儲存、免疫反應和信號傳遞在細胞膜處發生并通過膜蛋白進行。另一方面，藥物透過膜本身的滲透性是制藥工業中的重要問題，因為許多藥物必須滲透該膜才能到達它們在細胞內的靶。但是，研究這些膜蛋白(全細胞膜片鉗法 (whole cell patch-clamp methods))和膜滲透性(Caco-2 或 PAMPA 滲透性檢測法)的傳統方法具有許多缺點，這使它們作為藥物篩選法的標準工具的應用復雜化。芯片可用于監測膜轉運過程，尤其是跨過生物膜的藥物滲透或跨過含離子通道的膜的離子轉運。這種芯片從WO 2005/064342中獲知，其詳細描述了這種芯片的使用背景和益處。其還描述了作為生物有效層的膜，其是細胞膜或脂雙層，以及該芯片的功能和結構。一類重要的膜蛋白是G-蛋白偶聯受體(GPCR)，其構成細胞膜受體的最大亞類。這些受體的大約一半被視為藥物的靶。GPCR充當從細胞外部向內部傳送信號(如光子、氣味劑、激素和神經遞質)的信號轉導蛋白，其中通過相應的G-蛋白引發各種類型的反應級聯。 G-蛋白共價錨定到脂雙層且目前根據α-亞基的性質分成四族，它們與不同的靶膜蛋白 (target membrane proteins),如酶或離子通道相互作用。在G-蛋白離解后，α -亞基在脂雙層內側向擴散，鍵合到靶蛋白上并激活該靶蛋白。在下面略述的體外檢測系統的幾乎所有情況下，組成未知的生物膜固定在固體載體上，這通常造成脂雙層的有限流動性和膜蛋白的結構擾動(structural disturbance)。因此,在大量藥物篩選活動中非常不希望遇到這些情況，因為在檢測過程中，可能極大干擾蛋白質的天然功能。第二類重要的膜蛋白是離子通道。這些電壓-或配體-門控的通道以下述事實為特征它們將沿它們的電化學梯度向下(down to their electrochemical gradient)跨膜傳送大量離子(達到IO8個離子/秒)。這通過這些蛋白質的構象變化實現，其可以在數毫秒內打開和關閉它們的通道結構。許多已知疾病，如心力衰竭，與特定離子通道的功能障礙相關聯，這因此也被踴躍研究。對離子通道的功能和結構研究的選擇方法是膜片鉗技術。這種技術由通過在膜各側上放置電極來利用這些蛋白質的高離子轉運速率的電化學測量構成。 通過使用該提出的高度復雜的檢測系統，實現對相關膜蛋白的功能的更深入洞悉。學術研究和藥物發現都獲益于這種認識。第三類重要的膜蛋白是轉運蛋白。與離子通道相反，它們能在能量消耗下逆著電化學梯度跨過生物膜主動轉運離子或其它分子。但是，與離子通道相比，這些蛋白質的轉運速度(速率)遠低于離子通道(轉運蛋白(transporter)最多IO4 /秒vs.通道IO8 /秒)， 使得主動轉運蛋白不適合電化學測量。除蛋白質介導的信號轉導和轉運過程外，另一可能是分子有可能穿過脂雙層簡單(被動)擴散。這一方面對必須以高速率穿過膜但由于小且溶劑化差而可以獨力完成這一點的分子如O2和CO2而言是重要的，另一方面對不存在特異性載體以促進細胞滲透的許多藥物是重要的。藥物通過穿透腸內側(lining)的細胞而吸收到血流中的能力因此代表制藥公司的藥物剖析法(drug profiling process)中的重要參數。由于大部分藥物(>80%)通過被動擴散穿過腸上皮來進入血流，預測口服藥物的被動滲透的檢測法變得越來越重要。通常通過經UV-分光光度檢測或在這些化合物不吸收紫外線的情況下經LC-MS (液相色譜-質譜法)分析測量各化合物的濃度來進行藥物候選物的被動擴散的測定。對 UV-分光光度分析而言，上文提到的人工膜檢測和Caco-2細胞基檢測都沒有提供在線測定濃度的可能性，因為浸潰的過濾器在光學上不適合透射測量。任選地，也可以使用任何其它不常見的已知測定方法。上文提到的現有技術芯片用于穿過膜孔的電化學測量。被動擴散法尤其需要在多個小時的總測量期間穩定的膜。已知的膜在孔區域中缺乏充足的穩定性，這以不合意的方式影響測量結果。基底至少包含氮化硅表面。因此，本發明的目的是提供在用于生物傳感器和藥物篩選應用的芯片基膜系統中的改進的光學測量方法，其適用于工業生產和通用用途。通過如權利要求I中所述的方法解決該問題。在從屬權利要求中要求保護進一步有利的實施方案。根據本發明，該方法包括
提供至少具有具有頂面和背面和至少一個納米孔或微孔的基底和覆蓋所述至少一個孔的膜的芯片；
至少在所述至少一個孔的區域中提供材料層以在所述至少一個孔處支承該膜以允許穿過該膜和該孔轉運；
將含有至少一種分子或離子的流體施加至該膜的頂面以使該分子或離子穿過該膜、所述至少一個孔和該材料層移動；和
使用光學檢測監測已穿過該膜、所述至少一個孔和該材料層的分子或離子。該納米孔基底可能由含娃和碳的材料制成，但也可以由聚合物、金屬、電介質、玻璃或陶瓷制成。至少在所述至少一個孔的區域中提供該材料層以在所述至少一個孔處支承和穩定該膜，但不阻礙穿過該膜和該孔轉運。該材料層通常置于基底的背面或頂面上。在基底背面上提供材料層在制造過程中具有一些優點，但是，也可以提供具有在基底頂面上的該材料層的工作芯片。通過監測分子，檢測施加至膜頂面并到達背面的流體中的分子濃度。通常，光學檢測提供候選物是否能穿過該膜的信息和相應的動力學數據。尤其可通過光譜學方法，尤其通過 UV/VIS吸收或熒光光譜學進行光學檢測。對后者而言，受分析的分子可以是自體熒光或帶有特異性熒光標記。測得的熒光信號也可能受跨膜分子的轉運影響(放大或淬滅)。特別有意義的是候選物穿過該膜所需的時間。根據機制(被動擴散、離子通道或主動轉運蛋白)，穿過時間在寬范圍內變動。由于該穩定的材料層，本發明的方法能夠實時測量可能花費例如 48小時或更久的長效擴散過程。該方法提供所述材料層，其由充分支承細胞膜但足夠多孔以便允許穿過該細胞膜的物質也能穿過該材料層的任何種類的多孔材料制成。本領域技術人員已知的具有這種特征的所有材料，優選例如聚合物、凝膠或多孔疏松材料(porous bulk material),都適合在孔區域中支承和穩定該膜。該聚合物材料層可包括不帶電的聚合物，如藻酸鹽，或帶電聚合物，如聚合電解質多層(PEM)。后者可通過逐層法(layer-by-layer method)用不同的聚合電解質制造。例如，聚合電解質可選自聚醚酰亞胺(PEI)、聚烯丙胺(PAH)、聚谷氨酸(polyglutamatacid, PGA)或聚苯乙烯橫酸鈉(polystyrolsulfonat, PSS)。重要的是，PEM 膜通過將該PEM用于融合或通過利用芯片的SiN表面來促進脂雙層形成。在后一情況下， PEM應不干擾SiN囊泡相互作用。此外，PEM膜必須是離子可穿透的并且不干擾通道轉運測量，也與尚子通道相容。該聚合物優選是用公知的逐層法制造的聚合電解質或親水聚合物；該凝膠是水凝膠，該疏松材料是微米_/納米-多孔硅或金屬或陶瓷。該材料層有利地通過公知的旋涂或噴涂技術沉積或是燒結層。根據一個優選實施方案，該方法提供被帶有所述材料層的所述納米孔芯片隔開的兩個隔室，優選為微量滴定板格式的孔，其在水平(在一個孔內)或垂直(在兩個孔之間)方向，在后一情況下能通過UV/VIS吸收或熒光光譜法直接測量化合物濃度并因此也能在線測定動力學數據。具有分子的流體經過孔從一個隔室移動到另一隔室。通過用轉運分子進行熒光光譜法，另一隔室中的熒光受到影響，通過引發熒光而提高或通過淬滅該隔室中現有的突光而降低。本發明能夠監測長效被動擴散過程或對功能膜轉運蛋白的動力學和毒理學研究。 因此，就響應要篩選的潛在藥物化合物的膜蛋白的完整功能性而言，本發明的方法可用于藥物發現法(drug discovery process)。本發明適用于如上提到的所有種類的膜蛋白。下面聯系附圖
聯系優選實施方案詳細描述本發明。本發明的單個特征可以單獨實現或與說明書或權利要求的其它特征聯合實現。
附圖示意性描繪了在圖I中描繪了在基底背面上帶有材料層的通過本發明的方法提供的芯片的橫截面視圖，
在圖2中描繪了在基底頂面上帶有材料層的通過本發明的方法提供的芯片的橫截面視圖，且
在圖3中描繪了使用兩個隔室和UV分光光度法的本發明的一個實施方案的示意圖。這些圖顯示具有基底2的芯片1，該基底2具有孔3。芯片I包含多個這樣的孔3， 并在根據WO 2005/064342的一個實施方案中包含100平方毫米總面積的可由含硅和碳的材料也可由聚合物、金屬、電介質、玻璃或陶瓷制成的陣列基底(array substrate)。合適的據此是指該載體材料的性質允許膜4與基底的粘合。例如400 X 400 μ m的孔陣列段(pore array section)包含直徑為50至2000納米的孔。選擇孔3相互之間的距離(間距)以在它們直徑的范圍內。這確保膜蛋白和要篩選的化合物的相當高的分子密度，也徹底減少了膜蛋白和要篩選的化合物的量。在圖I中，膜4直接粘附到基底2的頂面上。膜4也是從WO 2005/064342中公知的，分子5示例性穿過膜4和孔3。在基底2背面上是通過公知沉積技術沉積的材料層6， 其覆蓋背面并在孔3 (和所有其它孔)中穿透以在孔3的區域中支承和穩定膜4。材料層6 是充分支承細胞膜4但足夠多孔以便允許穿過細胞膜4的物質也能穿過材料層6的任何種類的多孔材料。在該情況中，其是由PSS/PAH制成的PEM。這一對促進囊泡融合。但是，其它配對也可行。 圖2顯示置于基底2與膜4之間的材料層6。在這些圖的這兩種實施方案中，在施加膜4之前在基底2上沉積材料層6。圖3以示意性方式描繪納米孔芯片I，其在壁7中分離兩個隔室A和B，優選為微量滴定板格式的孔，以水平(在一個孔內)或垂直(在兩個孔之間)方向分離，在后一情況下能通過UV分光光度法直接測量化合物濃度并因此也能在線測定動力學數據。隔室A中的流體8中分子5的濃度開始時高于隔室B中的濃度。在這兩個隔室中的被動擴散程序結束時，理想地，濃度相同。通過監測動力學數據，測定滲透系數。
權利要求
1.測量細胞膜或脂雙層的轉運性質的方法，包括提供芯片(I )，其至少具有具有頂面和背面和至少一個納米孔或微孔(3)的基底(2)和覆蓋所述至少一個孔(3)的膜(4)；至少在所述至少一個孔(3)的區域中提供材料層(6)以在所述至少一個孔(3)處支承該膜(4)以允許穿過該膜(4)和所述至少一個孔(3)轉運；將含有至少一種分子(5)或離子的流體(8)施加至該膜(4)的頂面以使該分子(5)或離子穿過該膜(4)、至少一個孔(3)和該材料層(6)移動；和通過使用光學檢測法監測已穿過該材料層(6)的該分子(5)或離子。
2.權利要求I的方法，其特征在于通過UV/VIS吸收或熒光光譜學進行光學檢測。
3.權利要求I或2的方法，其特征在于提供材料層(6)，其由充分支承該膜(4)但足夠多孔以允許穿過該膜(4)的物質也穿過該材料層(6)的任何種類的多孔材料，如聚合物、凝膠或多孔疏松材料制成。
4.權利要求3的方法，其特征在于該聚合物是聚合電解質或親水聚合物。
5.權利要求3的方法，其特征在于該凝膠是水凝膠。
6.權利要求3的方法，其特征在于該疏松材料是微米_/納米-多孔硅或金屬或陶瓷。
7.前述權利要求任一項的方法，其特征在于通過旋涂或噴涂沉積該材料層(6)。
8.前述權利要求I至6任一項的方法，其特征在于通過燒結制造該材料層(6)。
9.前述權利要求任一項的方法，其特征在于提供被該芯片(I)隔開的兩個隔室(A，B) 以直接測量一個隔室(B)中的化合物濃度、用于研究或宏觀檢測所述兩個隔室(A，B)之間的分子過程(molecular processes)。
10.前述權利要求任一項的方法，其特征在于在短和長持續時間內光學實時測量穿過該芯片(I)的分子(5)或離子。
全文摘要
本發明描述測量細胞膜或脂雙層的轉運性質的方法，包括至少提供具有頂面和背面和多個納米孔或微孔的基底和從細胞膜的兩面均可進入以供測量的覆蓋所述多個孔隙的細胞膜、位于基底頂面或背面上的至少在孔隙區域中的材料層以在孔隙處支承該細胞膜但不阻礙穿過該細胞膜和孔隙轉運，將含有至少一種分子的流體施加至該膜的頂面以使該分子或離子穿過該膜、孔隙之一和該材料層移動；和使用光學檢測法監測已穿過該材料層的分子。本發明能夠監測長效被動擴散過程或對功能膜轉運蛋白的動力學和毒理學研究。
文檔編號G01N21/64GK102590525SQ201210003078
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月6日 優先權日2011年1月7日
發明者J.弗勒斯, K.蘇基哈拉, M.D.貝拉爾迪諾, T.扎貝利 申請人:阿克塞特里斯股份公司