檢測α-葡聚糖的金標試紙及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種半定量檢測α-葡聚糖的金標試紙，可廣泛應用于制糖、醫療等行 業中。
【背景技術】
[0002] 日-葡聚糖(dextran)又稱右旋糖酢，是一類D-化喃葡萄糖的聚合物的總稱，通過α- 1，6糖巧鍵形成主鏈，少量的支鏈部分則由α-1，2, α-1，3和α-1，4糖巧鍵形成。分子式 為(C出10〇5)η，分子量一般由數萬到數百萬，從可溶性小分子到不可溶的高分子，呈膠粘狀， 粘度隨分子量和濃度的增加而增加。α-葡聚糖呈白色粉末狀，無臭、無味，通常可溶于水、薦 糖溶液、氯化鋼溶液中，溶解性隨分子量和濃度的增加而下降。不溶于乙醇，常溫穩定，加熱 逐漸變色或分解。用稀酸水解后，得部分解聚產物;若長時間水解，可得葡萄糖。右旋糖酢經 堿性降解反應，產物的粘度隨水解時間的長短而顯著不同。α-葡聚糖是最早發現的微生物 多糖，是世界上第一個工業化生產的微生物多糖，也是美國FDA批準的第一種可用于食品 的微生物胞外多糖。
[0003] 在甘薦制糖生產過程中出現的α-葡聚糖，俗稱"薦飯"。新鮮甘薦中α-葡聚糖的含 量很少，幾乎為零。但甘薦如受到刀傷或壓傷、病蟲害、火燒、霜凍或在收割后放置長時間， 就會受到腸膜明串珠菌化euconostoc mesnteroides)、鏈球菌屬（Sheptococcus)等微生 物的感染而形成葡聚糖。運些微生物在適宜的溫度和濕度下，能夠分泌葡聚糖薦糖酶 (dextransucrose)，催化薦糖生成葡萄糖并聚合而生成多糖體，從而產生α-葡聚糖。從薦汁 到精制產品，制糖工藝過程自始至終存在著α-葡聚糖引起的不良影響。薦汁中α-葡聚糖的 存在意味著糖分轉化損失，粘度增大，澄清、過濾、蒸發、煮糖(結晶）、分蜜受影響，收回降 低，成本增加，產品質量下降，影響產品的適用性。因此，α-葡聚糖的監測成為糖廠生產控制 的一個重要技術。
[0004] 制糖工業中α-葡聚糖的測定一般可用化zeパCUMSA法、Robeパ's銅法、Potical Activity Ltd.DASA法、酶解法等，但運些方法都有較大的局限性，如準確度不高、操作繁 瑣、不適用所有糖品等缺點。其中測定α-葡聚糖的兩個主流方法，HAZE法和Robeds方法，或 者基于運兩種原理的衍生方法，都屬于化學測定法。運兩種測試方法都要利用到α-葡聚糖 在酒精溶液中沉淀的特性。α-葡聚糖的運些定量測定方法在長期W來的應用中存在可靠 性、精確性、特異性均不高，價格昂貴和操作繁瑣費時的缺點。而高效液相色譜法，則存在著 儀器設備要求高，測試時間長，樣本處理難的問題。
[0005] 膠體金免疫層析技術作為一種檢測技術，其特點是方便快捷，除少量試劑外無需 任何儀器設備，幾分鐘即可肉眼觀察結果。膠體金試紙條的樣品前處理簡單，抗干擾能力 強，能滿足分析要求，適用于大量樣品的定性和半定量初篩。本發明的半定量檢測α-葡聚糖 的膠體金試紙條具有化ISA方法的高靈敏度，大幅降低檢測成本。對于在制糖行業中便捷、 準確檢測原料、中間物料、產品及副產品中的α-葡聚糖是很有意義的。檢索結果表明，尚未 有半定量檢測α-葡聚糖濃度的方法，也沒有利用膠體金法對α-葡聚糖進行半定量檢測的報 道。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于提供一種檢測α-葡聚糖的金標試紙及檢測方法。
[0007] 本發明所采取的技術方案是： 一種檢測α-葡聚糖的金標試紙，其包括底板，底板上依次相連的樣品墊、金標墊、反應 膜W及吸樣墊； 在金標墊上包被有膠體金標記的抗α-葡聚糖的單克隆抗體或抗α-葡聚糖的多克隆抗 體。
[0008] 反應膜位于金標墊一端設有檢測區，遠離金標墊一端設有質控區，所述檢測區上 設置了 1條或多條互相平行的檢測線，檢測線上包被有α-葡聚糖-蛋白交聯物。
[0009] 所述質控區設置有質控線，質控線上包被有羊抗鼠抗體IgG。
[0010] 所述α-葡聚糖-蛋白交聯物的制備方法為： 1) 將α-葡聚糖與蛋白混合，用水溶解，冷凍干燥，研磨成粉； 2) 將粉末置于50~60°C的恒溫，反應至少3天，得到α-葡聚糖-蛋白交聯物。
[0011] 作為優選的，所述蛋白為牛血清白蛋白或卵清蛋白中的一種。
[0012] 作為優選的，所述α-葡聚糖的分子量在10~2000kDa。
[0013] 所述抗α-葡聚糖的單克隆抗體的制備方法如下： 1) 將α-葡聚糖-蛋白交聯物與佐劑混合，乳化，注射到動物體內； 2) 選取血清效價高的動物體，取其脾細胞制成懸液，并與對數生長期的瘤細胞混合，介 導融合、篩選得到可W分泌α-葡聚糖特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株； 3) 使用雜交瘤細胞生產得到α-葡聚糖特異性單克隆抗體或使用腹水法生產得到α-葡 聚糖特異性單克隆抗體。
[0014] 作為優選的，所述抗α-葡聚糖的單克隆抗體由雜交瘤細胞株D9分泌得到，所述雜 交瘤細胞株D9已于2010年12月7日保藏于中國典型培養物保藏中屯、，保藏編號為CCTCC NO: C2010107。
[001引一種半定量檢測α-葡聚糖的試劑盒，包括外盒體和盒內支架，所述盒內支架上設 置有試紙條凹槽可放置金標試紙。
[0016] 作為優選的，所述盒內支架上還設置有若干試劑管孔，孔內放置有試劑管，試劑管 中分別盛裝的試劑包括α-葡聚糖標準品溶液、樣品稀釋液。
[0017] 本發明檢測α-葡聚糖的金標試紙的原理是：用膠體金標記抗α-葡聚糖的單克隆抗 體，將該金標抗體包被于金標墊上。在檢測線上包被有一定量的α-葡聚糖-蛋白交聯物。當 將待檢樣品到達金標墊后，若樣品中含有一定量的α-葡聚糖時，則α-葡聚糖會與膠體金標 記的抗體結合，從而抑制金標抗體與檢測線上的抗原結合，無法聚集在檢測線。若樣品中所 含的α-葡聚糖低于一定的量，不足W與全部的膠體金標記的抗體結合，則剩余未結合的金 標抗體將與檢測線上的抗原結合，聚集在檢測線。通過在試紙條上設置多條間隔的檢測線， 可W實現α-葡聚糖的半定量檢測。制作該試紙條時，通過確定各檢測線上包被的α-葡聚糖- 蛋白交聯物的量，限定每條檢測線只能夠結合一定量的膠體金標記抗體。距離膠體金墊由 近到遠，檢測線顯色時所代表的α-葡聚糖含量依次減少。根據檢測結果中出現檢測線的數 量，判斷樣品中α-葡聚糖的濃度范圍。
【附圖說明】
[001引圖1為本發明檢測α-葡聚糖的金標試紙結構示意圖（1為樣品墊，2為金標墊，3為反 應膜，4為檢測線，5為質控線，6為吸樣墊）； 圖2為檢測結果示意圖（α-葡聚糖濃度小于5ng/ml); 圖3為檢測結果示意圖（α-葡聚糖濃度為5-20ng/ml); 圖4為檢測結果示意圖（α-葡聚糖濃度為20-5化g/ml); 圖5為檢測結果示意圖（α-葡聚糖濃度大于50ng/ml)。
【具體實施方式】
[0019] 下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0020] 實施例1: α-葡聚糖金標試紙條的制備方法 1.膠體金的制備： 采用巧樣酸Ξ鋼還原法制備膠體金。取50ml 0.1 mg/ml的氯金酸溶液，100 r/min攬拌， 加熱至沸騰，加入2ml lOmg/ml巧樣酸鋼溶液，保持原有的反應溫度和攬拌速度，繼續沸騰 反應5min，至溶液顏色剛剛變為清亮橘紅色后停止反應。冷卻，并置于棟色瓶中4°C避光保 存。經電鏡檢測，膠體金粒徑為10-15nm。
[0021] 2. α-葡聚糖和BSA、OVA交聯物的制備 將日-葡聚糖Dextran T-40與BSA按1:1比例混合，用水溶解調至6% (W/V)，冷凍干燥。研 磨成粉末狀后于60°C環境放置，并在容器底部放置