專利名稱：一種檢測低豐度低分子量蛋白譜的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于化學測定技術領域，特別是涉及一種用于直接檢測復雜樣品中低豐度低分子量蛋白譜的試劑盒。
背景技術：
近年來，隨著群體蛋白質組學概念的提出和其在實際研究中的應用，實驗研究和臨床應用之間的距離將進一步縮短。由于人體體液中因疾病引起的蛋白質的含量及種類變化是臨床上各種病癥早期診斷及評價病情的重要指標，因此應用現代生物技術，尋找與疾病相關的特異性蛋白變化是當前研究的熱點。然而，迄今為止能用于常規臨床檢測的生物標志物還非常的少。理論上，因為蛋白質的分子量較大，較難進入體液循環中，而一些蛋白質降解后的片段，卻有可能通過某種途徑進入到體液或血液中。以血清 為例，近年來，血清蛋白質組中的低分子量范圍頗受關注。而質譜技術的迅速發展和廣泛使用，又為血清蛋白質組中的低豐度低分子量范圍的研究提供了有效的手段。現有的針對低分子量蛋白檢測的方法一般是使用電泳等分離技術對蛋白分子量進行篩分后用富集材料將目標分析物進行富集，再輔以后續的洗脫步驟，從而進行質譜檢測。這種方法步驟繁瑣，多步的分離和洗脫操作可能將微量的低分子蛋白丟失，并且需要相當龐大的檢測設備。目前，低豐度低分子量蛋白質的分析的難點主要在于1)在分離過程中容易丟失和被其它高分子量的蛋白酶降解；2)在質譜鑒定過程中容易被其他高分子量蛋白質的信息掩蓋；3)更容易受到鹽、表面活性劑等小分子的干擾影響質譜鑒定等。

發明內容
本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種便攜的試劑盒，用于檢測低豐度低分子量蛋白譜。為此，本發明采用的技術方案是這樣的一種檢測低豐度低分子量蛋白譜的試劑盒，包括盒體，盒體內設有分離裝置、蛋白分離富集材料、稀釋緩沖液、清洗緩沖液，蛋白分離富集材料放置在分離裝置中，其特征在于所述的蛋白分離富集材料為多孔硅顆粒，孔道直徑在l_50nm之間，其孔道表面具有化學修飾基團，所述的化學修飾基團為陰離子交換基團或陽離子交換基團或疏水基團或極性基團。所述的化學修飾基團選自氨基、巰基或環氧基中的一種。進一步地，所述的蛋白分離富集材料是通過如下步驟得到的
A)將P型摻硼硅片固定在電解池中，按體積比為I:4 6的比例加入乙醇和重量濃度為40%的氫氟酸作為電解液，以硅片為陽極，鉬電極為陰極，進行直流電解刻蝕和脫膜，設定電流強度為0100mA，刻蝕時間為(Γ15分鐘，刻蝕脫膜后的多孔硅層用乙醇沖洗干凈后超聲粉碎5 20分鐘，再用氮氣吹干，所得的多孔硅顆粒的孔徑在5 20nm ；
B)將上述多孔硅顆粒進行臭氧氧化處理5 20分鐘，形成表面硅氧鍵；O將氧化后的多孔硅顆粒浸泡在體積濃度為1%的硅烷化試劑與有機溶劑的混合溶液中反應I小時，再在烘箱中110°c干燥15分鐘，蒸干后的多孔硅顆粒用乙醇浸泡洗凈；
D)選擇所需孔徑的多孔硅，用氨基硅烷化試劑、巰基硅烷化試劑或環氧基硅烷化試劑進行表面修飾。更進一步地，所述的分離裝置為離心管或微柱或芯片-微流控裝置。本發明在使用時，通過分離裝置及蛋白分離富集材料來得到所需的低豐度低分子量蛋白，然后進行MALDI-T0F檢測，獲得高質量的肽譜。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果
I、本發明通過制備多孔硅顆粒達到一步分離、富集和檢測血清樣品中低分子量蛋白的作用。多孔硅的孔徑大小可以通過電化學刻蝕條件精確控制，根據所要篩選的蛋白質分子 量大小，對相應材料的孔隙率進行選擇。通過表面修飾技術可以選擇性的捕獲低分子量生物標記物，同時將人血清中含量豐富的高分子量蛋白質和蛋白酶排阻在孔道外，防止了低豐度蛋白的降解。多孔硅顆粒的制備條件選擇是該分離材料性能優越的一項關鍵技術。2、本發明中材料的孔徑可以根據帶分析目標物的大小進行隨意調控，并利用多孔硅表面可進行多種化學修飾，可選擇性地從待測生物樣品中捕獲某一種類的目標蛋白質。同時，可以通過在各檢測點內修飾不同的基團，進行一種試樣的多維分析檢測。3、本發明中富集后的顆粒進行表面清洗后無需進行額外的洗脫除鹽步驟，即可進行MALDI-T0F檢測，獲得高質量的肽譜。檢測后多余的多孔硅顆粒可直接進行凝膠電泳分析，對感興趣的差異蛋白進行進一步的分離鑒定。避免了樣品多步處理和洗脫過程所造成的損失。4、本發明中設備簡單便攜，檢測方法準確快捷。整個測定過程一般可以在幾分鐘內就全部完成，十分迅速，簡單易行，且捕獲特異性高，同時不會破壞所測定的蛋白質。


圖I是本發明中微柱分離裝置示意圖。圖2是本發明中離心管分離裝置示意圖。圖3為I. O mg · mL—1胰島素樣品經過處理后的MALDI-TOF-MS檢測結果圖。圖4為采用本發明對患者血清樣品進行直接檢測MALDI-T0F-MS結果圖。
具體實施例方式實施例一多孔硅的制備
取P型摻硼硅片(100)晶型，固定在電解池中，加入O. 5ml乙醇，2-3ml質量濃度為40%的氫氟酸作為電解液，以硅片為陽極，鉬電極為陰極，進行直流電解刻蝕和脫膜，設定電流強度為l(T80mA，刻蝕時間為5分鐘，刻蝕脫膜后的多孔硅層用乙醇沖洗干凈后超聲粉碎15分鐘，再用氮氣吹干，所得的多孔硅顆粒的孔徑在5 20nm ；
將上述多孔硅顆粒進行臭氧氧化處理20分鐘，形成表面硅氧鍵；
將氧化后的多孔硅顆粒浸泡在體積濃度為1%的氨基硅烷化試劑與乙醇溶劑的混合溶液中反應I小時，再在烘箱中110°C干燥15分鐘，蒸干后的多孔硅顆粒用乙醇浸泡洗凈；選擇孔徑為10-12nm的多孔硅，用十一碳烯酸進行表面修飾。
實施例二分離裝置一
參見圖1，為本發明一種分離裝置的實施例。圖中I為多孔硅顆粒，2為微柱，多孔硅顆粒放置在微柱中，實現對特定蛋白的分離富集。實施例三分離裝置二
參見圖2，為本發明另一種分離裝置的實施例。圖中I為多孔硅顆粒，3為離心管，多孔硅顆粒放置在離心管中，實現對特定蛋白的分離富集。實施例四對胰島素樣品的處理檢測
本實施例以26%孔隙率的經過十一碳烯酸修飾的多孔硅顆粒作為富集材料，對低濃度的胰島素樣品進行直接檢測，其具體步驟如下 I、樣品吸附
本實施例的胰島素樣品為醫用人體注射液，將胰島素注射液用生理緩沖液PBS稀釋成I. O mg · mL—1后作為待測溶液。吸附取四個離心管，分別標號1，2，3，4，各加入50 uL待測溶液，再在離心管2中加入3 mg未刻蝕的硅粉，在離心管3中加入3 mg孔隙率為26%的多孔硅顆粒，在離心管4中加入3 mg經過十一碳烯酸修飾的孔隙率為26%的多孔硅顆粒，四個離心管在室溫下共同振蕩孵育I h。分離將上述懸濁液靜置2 min,多孔硅顆粒沉降到離心管底部，用移液槍小心的移除上清液。2、樣品檢測
清洗在離心管中加入100 uL清洗緩沖液(O. 2 mmol · Γ1的PB緩沖液)，渦旋振蕩混勻后將懸濁液靜置2 min，用移液槍小心的移除上清液。再在離心管中加入100 uL去離子水，渦旋振蕩混勻后將懸濁液靜置2 min，用移液槍小心的移除上清液。檢測將清洗后的多孔硅顆粒用移液槍轉移到MALDI靶上，室溫自然干燥，然后將I uL的有機基質溶液(2-氰基-4-羥基肉桂酸，a -CHCA)點覆在顆粒表面，室溫自然干燥；將制備好的樣品送入MALDI-T0F質譜儀檢測。質譜檢測條件激光波長337 nm，激光脈沖頻率200 Hz，加速電壓20 kV，檢測范圍(TlO kD，延遲時間為220 ns，線性正離子模式檢測。回收檢測完畢后將多孔硅顆粒小心的從MALDI靶上轉移到離心管中，加入蛋白洗脫液(含有體積比為25%的乙腈和75%的三氟乙酸)，振蕩孵育20 min,將顆粒上吸附的蛋白洗脫下來。將上述懸濁液靜置2 min，用移液槍移除上清液，溶液揮發后得到的多孔硅顆粒可重新使用。檢測結果參見圖3，圖中，橫坐標表示質譜峰的質核比，縱坐標表示質譜峰的峰強度。16是樣品溶液用傳統方法直接點覆在MALDI靶板上檢測得到的，17是樣品經過硅粉吸附后，將硅粉點覆在靶板上檢測得到的，18是樣品經過多孔硅顆粒富集后，將多孔硅顆粒點覆在靶板上檢測得到的，19是樣品經過實施例一的多孔硅顆粒富集后，將多孔硅顆粒點覆在靶板上檢測得到的。19得到的樣品信號峰明顯高于傳統方法16。實施例五對患者血清樣品的處理檢測
本實施例以26%孔隙率的經過十一碳烯酸修飾的多孔硅顆粒作為富集材料，對患者的血清樣品進行直接檢測和分析，其具體步驟如下
I、樣品吸附本實施例的血清樣品從醫院獲得，血清樣品的制備采用醫學領域技術人員的常規操作，其中5-9為直腸癌患者血清，10-14為非癌癥患者血清，制備好的血清樣品儲存在-80で的超低溫冰箱。吸附將的血清樣品用生理緩沖液PBS稀釋10倍后取50 uL加入離心管中，再加入3 mg經過十一碳烯酸修飾的孔隙率為26%的多孔硅顆粒，得到的懸濁液在室溫下振蕩孵育I h。
分離將上述懸濁液靜置2 min，多孔硅顆粒沉降到離心管底部，用移液槍小心的移除上清液。2、樣品檢測
清洗在離心管中加入100 uL清洗緩沖液(0. 2 mmol じ1的PB緩沖液)，渦旋振蕩混勻后將懸濁液靜置2 min，用移液槍小心的移除上清液。再在離心管中加入100 uL去離子水，渦旋振蕩混勻后將懸濁液靜置2 min，用移液槍小心的移除上清液。檢測將清洗后的多孔硅顆粒用移液槍轉移到MALDI靶上，室溫自然干燥，然后將I uL的有機基質溶液(2-氰基-4-羥基肉桂酸，a -CHCA)點覆在顆粒表面，室溫自然干燥；將制備好的樣品送入MALDI-T0F質譜儀檢測。質譜檢測條件激光波長337 nm，激光脈沖頻率200 Hz，加速電壓20 kV，檢測范圍(TlO kD，延遲時間為220 ns，線性正離子模式檢測。回收檢測完畢后將多孔硅顆粒小心的從MALDI靶上轉移到離心管中，加入蛋白洗脫液(含有體積比為25%的こ腈和75%的三氟こ酸)，振蕩孵育20 min,將顆粒上吸附的蛋白洗脫下來。將上述懸濁液靜置2 min，用移液槍移除上清液，溶液揮發后得到的多孔硅顆粒可重新使用。檢測結果參見圖4。圖中，橫坐標表示質譜峰的質核比，縱坐標表示質譜峰的峰強度。5-9為直腸癌患者血清樣品，10-14為非癌癥患者血清樣品，15為未處理的血清樣品。對峰位置進行容差為0. 15%的對齊處理，并將峰強度進行歸一化處理，把相對信號強度低于0. 5的峰記為0，相對信號強度高于0. 5的峰記為1，將篩選挑選出來的峰用SPSS軟件進行分層聚類分析，分析結果說明本方法可以對血清樣品中的低豐度蛋白進行直接檢測，并可以初步將正常人和癌癥患者區分開，只有8號一例被歸入正常人中。
權利要求
1.一種檢測低豐度低分子量蛋白譜的試劑盒，包括盒體，盒體內設有分離裝置、蛋白分離富集材料、稀釋緩沖液、清洗緩沖液，蛋白分離富集材料放置在分離裝置中，其特征在于所述的蛋白分離富集材料為多孔硅顆粒，孔道直徑在l-50nm之間，其孔道表面具有化學修飾基團，所述的化學修飾基團為陰離子交換基團或陽離子交換基團或疏水基團或極性基團。
2.如權利要求I所述的一種檢測低豐度低分子量蛋白譜的試劑盒，其特征在于所述化學修飾基團選自氨基、巰基或環氧基中的一種。
3.如權利要求I所述的一種檢測低豐度低分子量蛋白譜的試劑盒，其特征在于所述的蛋白分離富集材料是通過如下步驟得到的 A)將P型摻硼硅片固定在電解池中，按體積比為I:4 6的比例加入乙醇和重量濃度為40%的氫氟酸作為電解液，以硅片為陽極，鉬電極為陰極，進行直流電解刻蝕和脫膜，設定電流強度為0100mA，刻蝕時間為(Γ15分鐘，刻蝕脫膜后的多孔硅層用乙醇沖洗干凈后超聲粉碎5 20分鐘，再用氮氣吹干，所得的多孔硅顆粒的孔徑在5 20nm ； B)將上述多孔硅顆粒進行臭氧氧化處理5 20分鐘，形成表面硅氧鍵； C)將氧化后的多孔硅顆粒浸泡在體積濃度為1%的硅烷化試劑與有機溶劑的混合溶液中反應I小時，再在烘箱中110°C干燥15分鐘，蒸干后的多孔硅顆粒用乙醇浸泡洗凈； D)選擇所需孔徑的多孔硅，用氨基硅烷化試劑、巰基硅烷化試劑或環氧基硅烷化試劑進行表面修飾。
4.如權利要求1-3任一項所述的一種檢測低豐度低分子量蛋白譜的試劑盒，其特征在于所述的分離裝置為離心管或微柱或芯片-微流控裝置。
全文摘要
本發明公開了一種檢測低豐度低分子量蛋白譜的試劑盒，包括盒體，盒體內設有分離裝置、蛋白分離富集材料、稀釋緩沖液、清洗緩沖液，蛋白分離富集材料放置在分離裝置中，所述的蛋白分離富集材料為多孔硅顆粒，孔道直徑在1-50nm之間，其孔道表面具有化學修飾基團，所述的化學修飾基團為陰離子交換基團或陽離子交換基團或疏水基團或極性基團。本發明中通過制備多孔硅顆粒達到一步分離、富集和檢測血清樣品中低分子量蛋白的作用。本發明設備簡單便攜，檢測方法準確快捷。
文檔編號G01N1/40GK102788833SQ20121025292
公開日2012年11月21日 申請日期2012年7月20日 優先權日2012年7月20日
發明者談潔, 趙偉潔, 鄔建敏 申請人:浙江大學