專利名稱：：對cea陰性胃癌檢測和預后判斷的質譜試劑盒和方法
技術領域：
：本發明涉及一種新的CEA陰性胃癌生物樣品中蛋白質分析方法的試劑盒。一種通過能與蛋白質結合的基質去捕獲生物標志，并用有定量控制的質譜分析來檢測CEA陰性胃癌生物標志。在此提及的此項發明涉及蛋白質檢測領域，為一種新的非侵入性的體外質譜檢測方法。本發明可以應用到已經脫離人體的體液中的CEA陰性胃癌生物標志組合的檢測方法或試劑盒。
背景技術：
：不論是細胞的正常功能還是病理特性都在一定程度上取決于細胞所表達的蛋白質功能。因此，鑒定人體內表達的蛋白質的區別，可用于體外疾病樣本診斷及篩査，并最終用于藥物開發和疾病治療。而要進行蛋白質表達和功能的差異化分析，要求能夠達到分辨細胞內分子的復雜混合物的程度。但細胞內許多物質往往以微量存在，目前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用這些常規手段難以進行化學結構及蛋白質序列鑒定分析。用質譜聯合可克服這一技術缺點。胃癌的發生是一個多基因突變導致抑癌基因失活、癌基因活化的過程。基因組學研究由于自身的限制難以完全闡明基因與蛋白質參與過程及其具體作用，而近年來蛋白質組學的發展為人們從整體上了解惡性腫瘤的發生、發展提供了較為理想的技術平臺。目前臨床上對惡性腫瘤預后評估主要依賴于臨床表現、病理學及傳統腫瘤標志(tumormarker),但腫瘤早期復發或轉移時常常無明顯臨床表現，而病理學證據很難得到且重復性差。我國胃癌發病率高，其死亡率又占各種惡性腫瘤之首位，因此，胃癌是一個嚴重危害我國人民健康的常見病，應引起重視。已有的腫瘤標志物CEA(S卩，癌胚抗原)單項指標的靈敏度僅為18-40%，目前沒有血清胃癌細胞淋巴結轉移的腫瘤標志物，難以用于胃癌早期檢測及胃癌正確分期。因此從血清中尋求特異生物標志物用于CEA陰性胃癌的檢測及分期是臨床急需解決的難題。傳統腫瘤標志CEA在胃癌預后評估中有重要價值，但臨床工作中也發現有相當比例的胃癌患者中因CEA表達陰性而無法檢測，同時對于CEA陰性胃癌患者的預后評估則缺乏有效的早期監測手段。我們在進行蛋白質質譜分析時發現沒有一個臨床CEA陰性胃癌質譜標準化的試劑盒。
發明內容本發明的目的是建立一種在CEA陰性胃癌生物樣品中檢測的方法。該方法為CEA陰性胃癌的早期檢測提供了新的途徑，并為進一步發現新的CEA陰性胃癌生物標志提供了基礎。本發明涉及一種通過生物標志結合的基質表面，并用定量性質譜分析來同時檢測多種生物標志狀態。本發明中的生物標志是利用一臺質譜儀來發現的。該設備的質量精確度約為+/-0.1%。基質是任何能與生物標志選擇性或特異性結合的物質。舉例說明，WCX陰離子，C8/C18疏水作用基質吸附劑，分離生物化學中的這些方法和由這些方法產生的吸附劑具有診斷反面的用途(即陰離子吸附劑捕獲陽離子蛋白質)。底基洗去未吸附的物質。任何適宜的洗液均可使用。生物標志首先能夠被具有能與生物標志物結合基質吸附表面捕獲，非吸附物能從基質上洗脫，吸附到底基的生物標志物在質譜儀中被檢測。生物標志通過離子發生源，如激光，被離子化，產生的離子被一個離子感受集合器收集，然后質量分析器分析那些通過的離子。之后，檢測器將檢測的離子信息轉換為質荷比。定量性控制及質譜激光能量調控每次測試前，用質譜的標準化質控血清，將標準化質控血清中用于定量的標準峰6634.0Da強度調至50%質譜信號強度的最大值。生物標志的檢測明顯地將與信號強度的檢測有關。這樣，生物標志的數量與質量都可以被檢測出來。飛行質譜對待分析物的分析生成飛行時間譜。該飛行時間譜的最終分析并不表示離子化能量攻擊一個樣本產生的單獨的脈沖信號，而是一系列脈沖的信號之和。這樣降低了干擾，并增加了動態范圍。該飛行時間數據受數據處理軟件的影響。軟件中數據處理主要包括轉換飛行時間與質荷比而產生質譜，降低基線而減少儀器的偏移量，和過濾高頻噪音而減輕高頻噪音。通過對生物標志的吸附和檢測而產生的數據可利用計算機的數據分析程序進行分析。該計算機程序分析這些數據以顯示檢測出的生物標志的數量，并顯示信號的強度和確定被檢測的每個生物標志的分子量。數據分析還能包括一系列的確定生物標志的信號強度和矯正數據對預定統計分布狀態的偏離。例如，通過計算與某些參數相關的每個峰值的高度，可規范觀測到的峰。該參數可能是由儀器和類似能量吸收分子等化學成分產生的不重要的干擾，這可以設置調零。計算機可以將計算結果數據轉換成各種形式來表現。其標準譜可以表示，但在一種形式中只有峰高和質量信息可以在譜帶中保留，產生一個較清晰的圖，并使具有幾乎相同分子量的生物標志物更易顯現。在另一種形式中，兩個或更多的譜比較，便于突顯獨特的生物標志物和那些高于或低于校準樣本的生物標志物。分析一般包括展示從待分析物得到的信號的圖譜中峰的鑒定。峰可以通過視圖進行選擇，軟件是可用的，它可自動檢測峰。一般情況下，該軟件通過鑒定信號具有信噪比高于一個選擇閾值并標記出在峰信號的質心處的峰的質量這樣的方式操作。在一個有效的程序中，比較許多譜線以認定出現在質譜中某一選定范圍內同樣的一些峰。該軟件的一個版本聚集所有出現在確定的質量范圍內的各條光譜的峰，對所有在質量(質荷比)中值附近的峰指定一個質量(質荷比)簇。發明中使用的生物標志是基質所捕獲。這些生物標記是進一步通過質譜(massspectrometry)測定其不同分子量來知道它們特定的身份。CEA陰性胃癌檢測多肽蛋白篩選。通過Marm-Whitney〃檢驗分析幾百種血清蛋白指紋峰，發現下述蛋白指紋或質譜圖譜可以用于區分正常與CEA陰性胃癌的血清。峰值CV〉30W或者p〈0.01為有顯著性差異正常與CEA陰性胃癌蛋白指紋或質譜圖譜的顯著性差異(+15Da)4077.5374161.5094408.3775460.7625918.2876122.7847949.69210284.308161.1438354.54613611.776459.8068627.9573299.3665587.7635047.1475348.8287511,5464627.5028712.4444431.4443541.5274858.2581465.6213854.6983283.0086639.9485814.5056004.3084310.1124223.49311683.23用Mann-Whitney〃檢驗比較配對樣本的蛋白峰，初步分析篩選出CEA陰性胃癌患者與健康人群有5個差異多肽蛋白，不同峰的分子量、均值及F值見表一-表一164例CEA陰性胃癌與164例年齡匹配的健康人生物樣品中的差異峰情況<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>從中篩選出幾個特征蛋白峰，5047，5461，8628i15Da3個差異峰組成的檢驗模型對CEA陰性胃癌患者和健康人群盲篩檢驗，用此分類法分析71份CEA陰性胃癌樣本的質譜結果，其中64份區分正確，7份區分錯誤，敏感性為90%:71份對照樣品中69份區分正確，2份區分錯誤，特異性為97%(見表二)表二生物樣品中檢驗模型的判別情況<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>利用C8及C18疏水基質磁珠或芯片的實驗結果與上述WCX陰離子基質磁珠或芯片的實驗結果一致。將1465.6Da生物標志用多級質譜(MS/MS)、源后裂解(PSD)及蛋白質梯狀排序法(proteinladdersequencing)進行排序。通過將分子碎成碎片，可生成蛋白質梯度(proteinladders)。然后，用質譜對此梯度進行分析。鑒別出1465土1Da蛋白為變異的纖維蛋白肽A(Fibrinop印tideA，FPA)(圖3)。其化學結構為(從N端至C端排列為15個氨基酸)N端Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-ArgC端。查已知基因組或cDNA庫數據庫中的正常纖維蛋白肽A分子的化學結構(從N端至C端排列16個氨基酸，分子量為1536Da):N端Ala-Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-ArgC端。用CEA檢測280例胃癌病人的血清有16.1%陽性；抗FPA檢測280例胃癌病人的血清有95%陽性；抗SAA檢測280例胃癌病人的血清有25.7%陽性。表三、區分正常人、胃癌生物標志群篩選試驗CEA檢測抗FPA-質譜法抗SAA-質譜法SI16.1%ii^25.7%(45/280)(266/280)(72/280)正常人5%17.9%0%(14/280)(50/280)(0/280)用抗FPA(抗纖維蛋白肽A)、抗SAA(抗血清淀粉樣蛋白A)及質譜法發現分子量為1465土15Da、11683i15Da生物標志的變化區分正常人、胃癌生物標志群變異表達具有重要意義(圖4、5)。因為蛋白質是由氨基酸組成的，而氨基酸的平均質量是已知的，如果知道了抗原或生物標志的總分子量，那么抗原的變異(指氨基酸變化)就很容易被推測出來。血清淀粉樣蛋白A(SAA，11683Da)序列N端RSFFSFLGEAFDGARDMWRAYSDMREANYIGSDKYFHARGNYDAAKRGPGGVWAAEAISDARENIQRFFGHGAEDSLADQAANEWGRSGKDPNHFRPAGLPEKYC端。此結果表明，抗FPA檢測胃癌病人的靈敏度為95M;抗SAA檢測胃癌病人的靈敏度為25.7%。消化系統腫瘤胃癌CEA靈敏度為16.1%。本發明利用WCX陰離子基質及利用C8/C18疏水基質磁珠為例對正常人與CEA陰性胃癌血清(漿)進行蛋白質對比分析。定量性控制及質譜激光能量調控每次測試前，用質譜的標準化質控血清(漿)，將標準化質控血清(漿)中用于定量的標準峰6634.0Da強度調至5cm質譜信號強度的最大值。一種CEA陰性胃癌檢測和預后判斷的質譜試劑盒和方法的具體操作步驟以下是用本發明提供的一個操作方案及CEA陰性胃癌檢測試劑盒實例。1.樣品處理及標準化質控血清(漿)制備將生物樣品稀釋在稀釋緩沖溶液中，視需要離心澄清樣品。質譜的標準化質控血清(漿)制備定義符合如下標準供血者10人，5男5女，血型為0型；年齡為18-30歲；民族漢。生化指標正常，包括總膽固醇、甘油三酯、空腹血糖、乙肝表面抗原、肝功檢査、腎功檢査；無遺傳病家族史；無重大傳染病史。女性不能懷孕，男性為不吸煙者。2.基質與CEA陰性胃癌、標準化質控血清(漿)制備、樣品上樣抽取0型血的健康受試者(男女各半)的新鮮血液(a)4'C下待血液凝固后馬上離心，4'C離心5min分離血清。(b)4'C下馬上離心，4。C離心5min分離血漿。標準化質控或CEA陰性胃癌血清(漿)樣品分裝10(Hil—小管，于—8(TC儲存；或取混合血清(漿)1:2稀釋于U9緩沖液(9MUrea，2%CHAPS,50rnMTris-HCL，pH9.0)一小管，25。C儲存。即成為CEA陰性胃癌、標準化質控血清(漿)試劑盒。將質譜的標準化質控血清及樣品點樣在有支持物的基質中的一個位點上。支持物用磁性珠或芯片。基質是用于標記、結合血清(漿)的。標記至液相色譜柱子上的基質可用液相色譜質譜聯用儀(LC-MS)的標準方法去分析。將質譜的標準化質控0血清(漿)用于質譜儀試劑盒的定量方法。3.洗滌用結合緩沖液洗滌。在樣品完全干燥前將第一份洗滌溶液加到該位點。洗滌溶液在位點上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重復以上步驟。以下步驟用0.05%1%三氟乙酸徹底洗滌整個磁性珠陣列點，將生物標志洗脫至質譜專用金屬片(有3x3mm圓孔)上，自然干燥金屬片，加0.5吸能分子(以50%乙腈，0.5%三氟乙酸制備的飽和標準溶液)。吸能分子可用Si卿inicacid或alpha-Cyano-4-hydroxycinnamicacid等。3.質譜的定量控制及測試用激光解吸/離子化飛行時間質譜儀，用氮激光儀(337nm)和80cm或120cm飛行管分析陣列，或用電噴霧電離己洗脫的生物標志后用液相色譜質譜^^用儀(LC-MS)標準方法去分析滯留于各位點的生物標志或蛋白質。用計算機分析數據進行數據重疊展示。定量性質譜調控每次測試前，用質譜的標準化質控血清(漿)，將標準化質控血清中用于定量的標準峰6634.0Da等強度調至5(m信號強度的最大值。定量性控制及質譜激光能量調控每次測試前，用質譜的標準化質控血清(漿)，將標準化質控血清(漿)中用于定量的標準峰6634.0Da強度調至50%質譜信號強度的最大值。用2746土1Da、5909土1Da、6634土1Da標準峰為質譜內標定性(分子量)質控標準。本發明將蛋白質分成了幾大類，即WCX陰離子、C8/C18疏水作用等蛋白。這樣，可用質譜儀直接進行分析及定量。利用C8及C18疏水基質磁珠或芯片的實驗結果與上述WCX陰離子基質磁珠或芯片的實驗結果一致。本發明可用于體外細胞和非侵入性的體外CEA陰性胃癌質譜檢測方法的定量控制，如離體體液的胃癌試劑盒用于臨床質譜的CEA陰性胃癌檢測方法。可以檢測多個胃癌蛋白質生物標志群及質譜多肽圖譜。本發明中的試劑盒及方法與其他非侵入性的體外檢測方法比較，具有以下的特點(1)準確質譜直接分析有很強的精確性，一般誤差率只有0.1Da。因為蛋白質是由氨基酸組成的，而氨基酸的平均質量是已知的，如果知道了抗原或生物標志的總分子量，那么抗原的變異(指氨基酸變化)就很容易被推測出來。(2)方便本方法將蛋白質分成了幾大類，即陰離子、疏水作用蛋白。這樣，可用質譜儀直接進行分析。支持基質的方法所用吸附劑的支持物是磁珠或芯片。用磁性分離器分離磁珠及樣品，無需離心樣品。磁珠表面的結合面積大于芯片，從而其靈敏性比芯片更高。這樣，可用質譜儀直接進行分析。(3)快捷用本發明提供的蛋白指紋法進行檢測時，無需對蛋白質進行瀾序。本發明采用了計算機"條碼格式"，信號強度沿著線性軸以暗度強度值顯示。此強度可以用掃描儀記錄并用分析軟件自動分析對比強弱，從而有助于臨床復雜的檢測，如可用此"蛋白指紋"或條碼格式進行醫學分析。說明書附1CEA陰性表達胃癌血清質譜多肽蛋白圖譜圖2CEA陰性表達胃癌及健康人群盲篩的敏感性、特異性及ROC曲線圖31465.63Da蛋白的排序鑒定圖4變異的纖維蛋白肽A的一個特征峰圖5變異的血清淀粉樣蛋白A的一個特征峰具體實施方式本發明將結合具體實施例作進一步說明，這些實例僅用于說明目的，而不用于限制本發明范圍。實施例1正常與CEA陰性胃癌患者的區分及質譜的試劑盒制備(1)實驗方法CEA陰性胃癌患者的術前血清280例，平均年齡47歲。健康體檢者280例，平均年齡45歲，來源于肝功能、腎功能等檢査均正常的體檢人群。受檢者空腹采集靜脈血1mL，采集后立即于4。C冰箱靜置2小時，4'C4000r/min離心10分鐘分離血清，將血清于4°C12000r/min再次離心5分鐘，去除所有殘留細胞碎片和不溶物，在冰上將血清分裝為10CmL/管，共5管，保存于-8(TC冰箱。避免反復凍融。蛋白質芯片及磁珠操作步驟血清樣品處理從-8(TC冰箱中取出血清，于4'C，10OOOrpm離心5min。取1(￥L血清樣品，加20叱U9處理液(9mol/L尿素，2%CHAPS,1%DTT，50ramol/LTris-CL，pH9.0)，充分混勻，冰浴振蕩30min后取出，加入360叱結合緩沖液(100廳1/LNaAc,pH4.0),立即混勻。芯片上樣及洗脫將WCX2芯片(弱陰型離子表面，羧基基團，捕獲正電荷基團蛋白)裝入bi叩rocessor中，每孔加入200ML結合緩沖液，室溫振蕩洗淶2次，每次5min，甩干。每孔分別加入100叱處理好的樣品，振蕩孵育lh,甩去樣品，用200yl芯片洗脫緩沖液(100ramol/LNaAc,pH4.0)室溫振蕩洗滌2次，每次5min,甩干；再用HPLCH20洗滌一次，立即甩千。取出芯片，每點加2次0.5叱SPA飽和溶液，晾干后上機測量。磁珠上樣及洗脫將處理好的樣品IOO叱加至已裝好WCX磁珠(弱陰離子表面，羧酸基團，捕獲正電荷基團蛋白)的PCR管中，置磁性處理器上孵育30min,除去液體。加IOO叱磁珠結合緩沖液(50mmol/LNaAc,pH4.04.3)至已裝好WCX磁珠的PCR管，置磁性處理器上孵育2分鐘，除去液體，重復上述操作2次。加10叱ElutionBuffer2min，洗脫標本至上清液。取5叱上清液移至另一個PCR管中，加入5叱SPA飽和溶液充分混勻，取lA混合溶液加樣到Au片上，晾干后上機測量。數據收集將處理好的Au片置入MALDI-T0F-MS進行蛋白質譜分析。在讀取數據前，用加有all-in-one標準蛋白質的芯片校正質譜儀，使分子量誤差〈0.1%。本研究中閱讀儀的主要參數設定為，最高檢測分子量為50kDa，優化分子量范圍100015000Da，最佳聚集中心8000Da,數據采集參數范圍2080，收集總數為130次。軟件中設定讀片程序，以讀取數據。用血清中的內標峰4091.1Da或6634.0Da校正原始數據中的蛋白指紋圖譜，使分子量誤差〈0.01%，從而獲得的精確的蛋白指紋圖譜。統計學分析應用軟件分析處理所有峰譜，形成蛋白指紋圖譜。所有的圖譜都進行了標準化，統一到它們自己全部的離子總數(峰面積的總和)。將標準化質控血清中用于定量的標準峰4091.1或6634.0Da強度調至4050%信號強度的最大值，并且用最顯著的峰進行了校正，而后又進行了"減少基線"，定義蛋白峰(s/n〉5，最小的峰強度>1.6)。分析所有l50kDa之間的蛋白峰，并且仔細檢查了每個相應的峰，計算出峰的平均數，標準誤差(SD)和變異系數(CV%)。用Mann-WhitneyV檢驗比較配對樣本的蛋白峰，計算p值.CEA陰性胃癌檢測取空腹靜脈血4mL，離心后提取血清，按照檢測系統步驟進行操作，正常參考值CEA<5ug/L(<5ng/ml)。CEA陰性胃癌檢測多肽蛋白篩選用Mann-Whitney〃檢驗比較配對樣本的蛋白峰，初步分析篩選出CEA陰性胃癌患者與健康人群有5個差異多肽蛋白，不同峰的分子量、均值及戶值見表一表一164例CEA陰性胃癌與164例年齡匹配的健康人生物樣品中的差異峰情況<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實施例2試劑盒的雙盲測試用從實施例1中篩選出幾個特征蛋白峰，5047，5461，8628土15Da3個差異峰組成的檢驗模型(圖1中上面四例為胃癌患者，下面四例為健康人群)對CEA陰性胃癌患者和健康人群盲篩檢驗及R0C曲線，用此分類法分析71份CEA陰性胃癌樣本的質譜結果，其中64份區分正確，7份區分錯誤，敏感性為90%;71份對照樣品中69份區分正確，2份區分錯誤，特異性為97%(見表二、圖2):表二生物樣品中檢驗模型的判別情況<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注敏感性90%(64/71);特異性97%(69/71)利用C8及C18疏水基質磁珠或芯片的實驗結果與上述WCX陰離子基質磁珠或芯片的實驗結果一致。實施例31465.6Da蛋白的排序鑒定將1465.6Da生物標志用多級質譜(MS/MS)、源后裂解(PSD)及蛋白質梯狀排序法(proteinladdersequencing)進行排序。通過將分子碎成碎片，可生成蛋白質梯度(proteinladders)。然后，用質譜對此梯度進行分析。鑒別出1465土1Da蛋白為變異的纖維蛋白肽A(Fibrinop印tideAwithalaninetruncationatN-terminal)(圖3)。其化學結構為(從N端至C端排列為15個氨基酸)N端Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-ArgC端。查已知基因組或cDNA庫數據庫中的正常纖維蛋白肽A分子的化學結構(從N端至C端排列16個氨基酸，分子量為1536Da):N端Ala-Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-ArgC端。實施例4變異的或修飾的生物標記抗體的制備變異的或修飾的生物標記的合成合成纖維蛋白肽A及血清淀粉樣蛋白A。血清淀粉樣蛋白A序列-N端RSFFSFLGEAFDGARDMWRAYSDMREANYIGSDKYFHARGNYDAAKRGPGGVWAAEAISDARENIQRFFGHGAEDSLADQAANEWGRSGKDPNHFRPAGLPEKYC端。將合成的變異的生物標記免疫小鼠，待免疫反應出現后，從外周血中分離B細胞。用溶血噬菌斑分析法選擇并分離出能分泌所需抗體的單個淋巴細胞。將單個細胞擴增至1X107個以上，用QuickmRNAPurificationKit提取mRNA。以提取的mRNA為模板，合成cDNA鏈。以此cDNA為模板，加入鼠抗體重鏈可變區(VH)通用引物，輕鏈可變區(V,)通用引物，進行聚合酶鏈反應，獲得擴增的Vh基因片段和Vl基因片段。將擴增產物在15g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定和分離。用glassmilk回收擴增的Vh基因片段和Vl基因片段。與等摩爾嘗試的LimkerPrimerMix混合，進行聚合酶鏈反應，逢接Vh和V,.。擴增產物分離純化后，獲得特異性單鏈抗體(ScFV)。此ScFV可用于制備檢測所需DNA片。將此擴增產物兩端加限制性酶切位點，純化定量后，連接到pu"9載體上。將連接產物轉化感染大腸桿菌TOPIO。經藍白斑篩選及酶切鑒定，篩選出重組質粒。在96孔板形成單克隆抗體。用ELISA法篩選出效價最高的單克隆抗體株，大量制備，并從培養上清中提取所需抗體。此抗體可用于制備檢測所需試劑盒。實施例5抗體與免疫組質譜檢測的應用(2)實驗方法一、材料1.標本來源A.280例正常人對照組的血清；B.280例胃癌病人的血清。2.質量控制A.人標準化質控血清B.質譜激光能量調控每次測試前，用上述標準化質控血清。3.基質含已標記的等量抗體抗FPA(抗纖維蛋白肽A)、抗SAA(抗血清淀粉樣蛋白A)。二、方法1.樣品的收集全血采集后吸取血清，置于一80'C保存；-8(TC冰箱中取出血清樣品，置冰盒上融解；以10,000轉/分，4。C離心2分鐘；取上清液。2.樣品的準備每個吸附劑支持物點需要血清lW，將血清用緩沖液稀釋，將樣品充分混勻。3.樣品檢測上樣，在吸附劑支持物(基質含已標記的等量抗體抗纖維蛋白肽A、抗血清淀粉樣蛋白A)中加入處理好的樣品，置振蕩器，400-600轉/分，震蕩3060分鐘。加入20(mi的結合緩沖液X2。加入200WHPLC水X1。取出吸附劑支持物后，待干后，樣品加入0.5Pl的SINAPINIC酸(5mg/mL50%乙腈；0.5%三氟乙酸)，任其自然干燥。4.將上述樣品加入質譜中，就會生成飛行時間質譜。外部使用多肽分子質量標準來校正質量精確性。實驗結果用統計學方法，通過分析血清蛋白指紋峰，發現下述生物標志可以用于區分正常人、消化系統腫瘤生物標志群變異表達(表三)。表三、區分正常人、胃癌生物標志群<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>CEA檢測280例胃癌病人的血清有16.1%陽性；抗FPA檢測280例胃癌病人的血清有95%陽性；抗SAA檢測280例胃癌病人的血清有25.7%陽性。發現分子量為1465土15Da、11683土15Da生物標志的變化區分正常人、胃癌生物標志群變異表達具有重要意義(圖4、5)。此結果表明，抗FPA檢測胃癌病人的靈敏度為95%;抗SAA檢測胃癌病人的靈敏度為25.7W。消化系統腫瘤胃癌CEA靈敏度為16.1%。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。權利要求1.一種用磁珠支持基質的方法捕獲體外生物樣品中CEA陰性胃癌蛋白質組的試劑盒和方法，其特征是采用蛋白指紋法對CEA陰性胃癌中體外樣品蛋白質組或質譜多肽圖譜進行鑒別檢測。用標準化質控血清(漿)控制下的定量性質譜分析來檢測。該方法通過以下步驟實現(1)樣品處理及質譜標準化質控血清(漿)制備；(2)基質與血清(漿)結合試劑盒制備、樣品上樣；(3)洗滌；(4)質譜的定量控制及質譜檢測；其中所述步驟(1)將生物樣品稀釋在稀釋緩沖溶液中。用O型血，男女相等，混合制備質譜的標準化質控血清(漿)；所述步驟(2)將質譜的標準化質控血清(漿)及樣品點樣在有支持物的基質中的一個位點上。支持物用磁珠或芯片。基質是用WCX陰離子基質及C8/C18疏水基質或抗體基質與血清(漿)選擇性結合；所述步驟(3)用結合緩沖液洗滌。在樣品完全干燥前將第一份洗滌溶液加到該位點。洗滌溶液在位點上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重復以上步驟。用三氟乙酸徹底洗滌整個陣列點，將生物標志洗脫至質譜專用金屬片或位點上。所述步驟(4)加0.5μL吸能分子(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸的制備的飽和標準溶液)用質譜儀去分析滯留與各位點的生物標志或用電噴霧電離已洗脫的生物標志后用質譜儀去分析。對血液進行蛋白質對比分析，用計算機分析血液中質荷比數據。本試劑盒依據幾個特征蛋白峰5047，5461，8628±15Da，雙盲測試CEA陰性胃癌體外樣品的敏感性90％，特異性97％。2.權利要求1所述的蛋白質分析方法，所用的基質包括陰離子、疏水作用及抗體吸附劑。3.權利要求2中所用吸附劑的支持物是磁珠或芯片。4.一種權利要求l所述的檢測試劑盒，其特征在于，它包括一容器以及裝于容器中的權利要求1所述的生物樣品。將生物樣品分裝100nl—小管，于一80'C儲存或取生物樣品1:2稀釋于一小管U9緩沖液(9ML)rea，2%CHAPS,50mMTris-HCL，pH9.0)，25°C儲存。5.如權利要求4所述的試劑盒，其特征于，所述的生物樣品為血清或血漿。6.—種權利要求1所述的檢測試劑盒對CEA陰性胃癌的預后判斷。7.—種權利要求1所述的檢測試劑盒用于CEA陰性胃癌的預后判斷的1465土15Da蛋白質是變異的纖維蛋白肽A。8.—種權利要求1所述的檢測試劑盒用于CEA陰性胃癌的預后判斷的11683土15Da蛋白質是變異的血清淀粉樣蛋白A。全文摘要本發明涉及一種用磁珠支持基質的方法捕獲體外生物樣品中胃癌蛋白質組，用磁性分離器分離磁珠及樣品，無需離心樣品。然后用質譜法進行分析的蛋白指紋法。本發明的方法可用于正常人與CEA陰性胃癌體外樣品檢測和預后判斷的蛋白指紋或質譜多肽圖譜的試劑盒。本方法準確、方便且快捷。文檔編號G01N30/02GK101271088SQ200710087170公開日2008年9月24日申請日期2007年3月23日優先權日2007年3月23日發明者洋許申請人:洋許